Мы разработали новый метод в электронной микроскопии, «флэш-и-сублимационной», что позволяет визуализировать динамику мембран с мс временным разрешением. Эта техника сочетает в себе оптогенетику стимуляции нейронов с замораживанием под высоким давлением. Здесь мы продемонстрируем процедуру и описания протоколов в деталях.
Клетки постоянно меняют свою архитектуру мембран и распределение белка, но это чрезвычайно трудно визуализировать эти события при временным и пространственным разрешением порядка мс и нм, соответственно. Мы разработали с временным разрешением метода электронной микроскопии, «флэш-и-Фриз», который вызывает клеточные события с оптогенетикой и визуализирует полученную динамику мембран путем замораживания клеток при определенных временных точках после стимуляции. Чтобы продемонстрировать эту технику, мы выразили channelrhodopsin, светочувствительный катионный канал, в нейронах гиппокампа мыши. Вспышка света стимулирует нейронную активность и индуцирует высвобождение нейромедиаторов из синаптических окончаний путем слияния синаптических везикул. Оптогенетика стимуляции нейронов в сочетании с замораживанием под высоким давлением, чтобы следовать морфологическим изменениям во время синаптической передачи. Используя коммерческий инструмент, мы захватили слияние синаптических везикул и восстановление synaptic пузырек мембраны. Для того, чтобы визуализировать последовательность событий, большие наборы данных были получены и проанализированы вслепую, так как морфологические изменения наблюдались в различных клетках с течением времени. Тем не менее, флэш-и-сублимационный позволяет визуализировать динамику мембран в электронных микрофотографиях с мс временным разрешением.
Визуальные мембраны и белки динамики в клетке является ключевым шагом на пути к пониманию клеточной биологии отдельных процессов. события Dynamic торговли людьми могут быть получены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Однако субклеточная контекст практически отсутствует в таких изображениях , поскольку субклеточные структуры не могут быть полностью «нарисованной» с помощью красителей или флуоресцентных зондов и решены пространственно и спектрально 1, 2. С другой стороны, в то время как электронная микроскопия может очертить внутриклеточную архитектуру в мельчайших деталях, он не может захватить клеточную динамику, потому что образцы должны быть исправлены до получения изображения. Таким образом, как правило, не достаточно, чтобы полностью понять клеточной динамики, используя только один модальности изображений.
Для того, чтобы преодолеть ограничения, световой и электронной микроскопии, были разработаны корреляционные методы микроскопии. Корреляционная световой и электронной микроскопии(CLEM) визуализирует динамику внутриклеточной с помощью световой микроскопии и лежащих в основе субклеточных структуры с электронной микроскопией. В CLEM, клетка , занятая в различных процессах, такие как цитокинез и эндоцитоз 3, 4, 5, 6, находятся под напряжением, отображаемый , а затем обработаны для электронной микроскопии. Хотя CLEM отражает некоторые аспекты внутриклеточной динамики, есть четыре фактора, которые ограничивают полезность этого подхода. Во- первых, временное разрешение ограничено , как быстро клетки могут быть иммобилизованы, который обычно занимает с – мин из – за медленной диффузии и реакции фиксаторов 7. Во- вторых, наблюдается субклеточная архитектура постфактум 8; Таким образом, динамические морфологические изменения не могут быть получены с помощью этого подхода. В-третьих, флуоресценции и электронные микрофотографии не могут быть точно выровнены за счет ш тканиrinkage вызвано обезвоживанием во время подготовки образца для электронной микроскопии 9, 10. В- четвертых, такие события , как цитокинеза и эндоцитоза не происходят в то же время в каждой ячейке 5, 11, и , таким образом, конкретная ячейка , которая занимается в том случае должны быть определены из большого числа клеток. Этот процесс часто трудоемкий. Таким образом, новый метод необходимо вызывать определенные события в каждой клетке и захватить в результате клеточной динамики от быстрой иммобилизации клеток в определенных временных точках.
В последнее время несколько инструментов, которые были разработаны, чтобы вызвать определенные клеточные динамики с использованием света (оптогенетика). Channelrhodopsin является светочувствительным, неселективный катионом канал изолирован от Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Когда channelrhodopsin выражается в neuronaл мембраны, кратко вспышка света вызывает приток ионов натрия в нейроны и вызывает действие потенциала 14, 15. Потенциал действия затем распространяется в синаптические окончания, где синаптические пузырьки сливаются в течение миллисекунд 16, 17, 18 Таким образом, channelrhodopsin индуцирует активность нейронов. Для того, чтобы следовать за динамикой мембраны при синаптических окончаниях, нейроны должны быть иммобилизованы в определенные моменты времени после стимуляции мса точности.
Для того, чтобы захватить динамику мембран после индукции нейронной активности, мы в сочетании световой стимуляции с замораживанием 17, 18, 19 высоким давлением. Замораживание высокого давления позволяет почти мгновенную иммобилизации клеток с образованием кристаллов уменьшенного льдом 20. Кристаллы льда чп разрыва мембраны и нарушают внутриклеточную архитектуру 21. Изменяя интервалы времени между стимуляцией и замораживанием, оборот мембраны в пределах синаптических окончаний было захвачен после индукции потенциала действия.
Здесь авторы демонстрируют экспериментальные процедуры с использованием фризера на коммерческую основу под высоким давлением, что пары в мс временной контроль световой стимуляции с замораживанием высокого давления. В отличие от других инструментов , которые требуют внешнего устройства для управления светом стимуляции и замораживание, световая стимуляция полностью интегрирована в этой системе , и может быть применен с точностью 19 мс. Этот процесс включает в себя несколько этапов. 1) гиппокамп мыши нейроны культивируют на сапфировых дисках и инфицировали лентивирусы , несущий вектор экспрессии для channelrhodopsin 18. 2) Нейроны стимулируются и замораживали при определенных временных точках после стимуляции. 3) остеклованный вода заменительд с органическим растворителем, в то время как липиды и белки являются сшитыми с помощью фиксаторов, чтобы сохранить внутриклеточную архитектуру. 4) Образцы инфильтрация и заливали в эпоксидной смоле. 5) Ультратонкие срезы собирают с использованием ультрамикротома. 6) Тонкие секции отображается на просвечивающем электронном микроскопе. 7) сбор и анализ изображений выполняются вслепую относительно моментов времени или генотипов. Клеточная динамика может быть определена путем реконструкции времяразрешенных изображений 17, 18. Пробоподготовка (шаги 2 – 5 выше) требуется неделя, но последующий анализ изображений требует месяцев до года.
«Флэш-и-замораживание» подход визуализирует динамику мембраны путем индукции конкретного клеточного события с оптогенетикой и путем замораживания клеток в определенные моменты времени после стимуляции 19. В этой демонстрации, мы использовали channelrhodopsin, светочувствительный катионный канал, чтобы стимулировать нейроны и захватили слияние и восстановление синаптических везикул в синаптических окончаниях. В последние годы многие оптогенетика инструменты были разработаны 22, 23, все из которых являются совместимыми с флэш-и замораживанию. Например, оборот органеллы может быть вызван с помощью светоиндуцированной гетеродимеризации криптохрома и CIB1 24. Кроме того , липидный состав плазматической мембраны может быть изменен светоиндуцированным транслокации фосфоинозитидного фосфатаза к плазматической мембране 25. Кроме того, небольшие, светочувствительные соединения, такие как азобензол чАнж конформации в зависимости от освещенности длин волн. Это конформационное изменение может быть использовано для активации лигандов каналов или для изменения липидного состава в мембране 26, 27. Caged соединение также может быть использовано для индукции клеточной активности. Тем не менее, индикатор, используемый в текущей установке не может производить достаточное количество энергии для uncaging; Таким образом, дальнейшие оптимизации системы, скорее всего, это необходимо. Тем не менее, применение этих светло-активируемых инструментов являются гибкими-многими клеточными события могут быть вызваны вспышкой света. «Flash-и замораживание» могут захватить получившуюся динамику мембраны.
Есть два основных ограничения метода «флэш-и-сублимационной». Во-первых, она захватывает «снимки» конкретного события из разных клеток. Другими словами, это не представляется возможным наблюдать за динамикой мембраны в одной камере в течение определенного периода времени. Таким образом, для восстановления любой сотовой связи дажет, необходимо приобретать и анализировать большое количество изображений из каждого образца и в каждый момент времени. Кроме того, в нейронах, еще большее количество изображений , необходимо, так как слияние синаптических везикул только занимает места в 20 – 30% синапсов в нейронах гиппокампа мыши 18, 28. Анализ такого большого набора данных требует огромного количества времени. В дальнейшем, для сбора и анализа изображения должны быть автоматизированы , чтобы сделать подход более эффективным , 29, 30.
Второе ограничение накладывается по характеру техники замораживания высокого давления. Когда клетки замерзают, клеточная вода перестраивает с образованием кристаллов льда , если скорость замораживания ниже 100 К / с 21. Эти кристаллы льда могут проникать мембраны или концентрат растворенных веществ, чтобы изменить местное осмотическое давление, что приводит к разрыву мембраны. Для того, чтобы избежать кристаллов льда, HIGч Давление (~ 2000 атм) применяется к образцам. Из – за супер-охлаждения эффект, морозильную скорость 100 К / с достаточно , чтобы вода не образуя кристаллы льда , при этом давлении 21. В теории, образцы толщиной 500 мкм, могут быть заморожены без кристаллов льда, но примерно 200 мкм, скорее всего, практический предел, поскольку кубовидные формы льда имеют тенденцию к образованию в толстой ткани, ставя под угрозу морфологию. При обработке образцов толщины более 5 мкм, использование надлежащего крио-протравитель, таких, как БС, необходимо. Однако БС изменит осмолярность раствора и может повлиять на физиологическую реакцию клеток. Таким образом, обширные контрольные эксперименты необходимы для проверки использования БСА в конкретных системах. Кристаллы льда могут также образовывать после замораживания высокого давления, если образцы случайно извлекают из ванны с жидким азотом. Таким образом, крайне важно, чтобы держать образцы в жидком азоте в любое время и использовать предварительно охлажденные щипцыманипулировать ими.
При планировании экспериментов, следующие три точки должны быть рассмотрены. Во- первых, максимальная интенсивность света (460 нм линия) составляет 5,5 – 8,0 мВт / мм 2. Независимо от того, достаточно, чтобы вызвать активность этой интенсивности должны быть проверено с живыми клетками на флуоресцентный микроскопе до начала вспышки и ЗАМЕРЗАНИЕ экспериментов. Во-вторых, эксперименты должны быть выполнены при физиологической температуре. Этап морозильной камеры высокого давления нагревают до 37 ° C для экспериментов с мыши нейронов гиппокампа 31. И, наконец, моменты времени должны быть тщательно подобраны, чтобы уловить динамику мембраны. Первоначальные исследования показали, что эндоцитоз завершается через 100 мс стимуляции. Таким образом, три дополнительных временных точках (15, 30, и 50 мс) были также исследованы , чтобы проследить динамику мембраны 17, 18. Эти моменты времени были необходимы, чтобы визуализировать события мембранныхы во время синаптической передачи. Тем не менее, требование в отношении количества временных точек различны в каждом клеточном случае. Таким образом, несколько моментов времени должны быть выбраны до начала большого сбора набора данных.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана финансирование из Университета Джона Хопкинса (SW). Мы благодарим Джона Хопкинса школы медицины Микроскоп фонда для оказания технической поддержки. Мы благодарим Эрика Йоргенсен и Крисчен Рознмунд и членов их лабораторий для развития техники. Мы благодарим М. Уэйн Дэвиса для разработки исходного устройства. Мы благодарим Пол Уерзингер, Квета Томова и Delgermaa Luvsanjav за техническую помощь. Мы также благодарим Натали Р. Гамильтон и Грант F Кьюзик за критическое прочтение рукописи.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |