Vi utvecklade en ny teknik i elektronmikroskopi, "flash-och frys" som möjliggör visualisering av membrandynamiken med ms tidsupplösning. Denna teknik kombinerar optogenetic stimulering av nervceller med högtrycks frysning. Här visar vi de förfaranden och beskriva protokollen i detalj.
Celler ständigt förändras deras membran arkitektur och distribution protein, men det är extremt svårt att visualisera dessa händelser på en tidsmässig och rumslig upplösning i storleksordningen ms och nm, respektive. Vi har utvecklat en tidsupplöst elektronmikroskopi teknik "flash-och frys" som inducerar cellulära händelser med optogenetik och visualiserar de resulterande membrandynamiken genom frysning celler vid definierade tidpunkter efter stimulering. För att demonstrera denna teknik, uttryckte vi channelrhodopsin, en ljuskänslig katjonkanal, i mus hippocampusneuroner. En ljusblixt stimulerar neuronal aktivitet och inducerar neurotransmitterfrisättning från synaptiska terminaler genom fusion av synaptiska vesiklar. Den optogenetic stimulering av neuroner kopplas med högtrycksfrysning att följa morfologiska förändringar under synaptisk transmission. Med hjälp av en kommersiell instrument, fångade vi fusion av synaptiska blåsor och återvinning av synaptic vesikelmembranet. Att visualisera sekvensen av händelser, genererades stora datamängder och analyseras blint, eftersom morfologiska förändringar följdes i olika celler över tiden. Ändå tillåter flash-och-frys visualisering av membrandynamiken i elektronmikrofotografier med ms tidsupplösning.
Visualisera membran och proteindynamik inom en cell är ett viktigt steg mot att förstå cellbiologin för speciella processer. Dynamisk människohandel händelser kan fångas med hjälp av ljus eller fluorescensmikroskopi. Dock är den subcellulära sammanhang i stort sett saknas i sådana bilder eftersom subcellulära strukturer kan inte vara helt "målade" av färgämnen eller fluorescerande prober och lösas spatialt och spektralt 1, 2. Å andra sidan, medan elektronmikroskopi kan avgränsa subcellulär arkitektur i utsökt detalj, kan det inte fånga cellulära dynamik, eftersom proverna måste fastställas före avbildning. Sålunda är det typiskt inte tillräcklig för att fullständigt förstå cellulära dynamik med hjälp av endast en avbildningsmodalitet.
Att övervinna begränsningarna av ljus och elektronmikroskopi, har korrelativa mikroskopitekniker utvecklats. Korrelat ljus- och elektronmikroskopi(CLEM) visualiserar intracellulära dynamik med hjälp av Ijusmikroskopi och underliggande subcellulära strukturer med elektronmikroskopi. I CLEM, celler som deltar i olika processer, såsom cytokines och endocytos 3, 4, 5, 6, är färsk avbildas och bearbetas sedan för elektronmikroskop. Även CLEM fångar vissa aspekter av intracellulära dynamik finns det fyra faktorer som begränsar nyttan av detta tillvägagångssätt. Först, den temporala upplösningen begränsas av hur snabbt cellerna kan immobiliseras, vilket typiskt tar s – min på grund av den långsamma diffusion och reaktion av fixativ 7. För det andra är den subcellulära arkitektur observerade efterhand 8; Således kan de dynamiska morfologiska förändringar inte tagits med denna metod. Tredje, fluorescens- och elektronmikrofotografier kan inte exakt inriktade på grund av vävnads shrinkage orsakas av uttorkning under provberedning för elektronmikroskopi 9, 10. För det fjärde gör händelser som cytokines och endocytos inte ske samtidigt i varje cell 5, 11, och därmed måste en viss cell som är engagerad i händelse identifieras från en stor population av celler. Denna process är ofta tidskrävande. Således, är det nödvändigt med en ny metod för att inducera specifika händelser i varje cell och för att fånga de resulterande cellulära dynamik genom den snabba immobilisering av celler vid definierade tidpunkter.
På senare tid har flera verktyg tagits fram för att framkalla särskilda cellulära dynamik med hjälp av ljus (optogenetik). Channelrhodopsin är en ljuskänslig, icke-selektiv katjonkanal isolerats från Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. När channelrhodopsin uttrycks i neuronal-membran, en kort ljusblixt inducerar ett inflöde av natriumjoner in i neuroner och utlöser en aktionspotential 14, 15. Aktionspotentialen utbreder sedan in i de synaptiska terminaler, där synaptiska vesiklar smälter inom millisekunder 16, 17, 18 Därför inducerar channelrhodopsin neuronal aktivitet. Att följa membrandynamiken vid synaptiska terminaler, måste nervceller immobiliseras vid definierade tidpunkter efter stimulering med ms precision.
Att fånga membrandynamiken efter inducering av nervaktivitet, kopplade vi ljus stimulering med högtrycks frysning 17, 18, 19. Högtrycks frysning möjliggör nästan ögonblicklig immobilisering av celler med nedsatt iskristallbildning 20. Iskristaller can brista membran och störa den subcellulära arkitekturen 21. Genom att variera tidsintervallen mellan stimulering och frysning, var membranet trafficking inom synaptiska terminaler fångade efter induktion av en aktionspotential.
Här visar vi experimentella procedurer med användning av en kommersialiserad högtrycks frys som kopplar en ms temporal kontroll av ljus stimulering med högtrycks frysning. Till skillnad från andra instrument som kräver en extern enhet för att styra ljus stimulans och frysning är lätt stimulering helt integrerat i detta system och kan appliceras med ms precision 19. Denna process innebär flera steg. 1) Mus hippocampala neuroner odlas på safir diskar och infekterades med lentivirus som bär en expressionsvektor för channelrhodopsin 18. 2) Neuroner stimuleras och frystes vid definierade tidpunkter efter stimulering. 3) Den förglasade vattnet är substitutd med ett organiskt lösningsmedel, medan lipider och proteiner är tvärbundna genom fixativ för att bevara den intracellulära arkitektur. 4) Proverna infiltreras och inbäddas i epoxiharts. 5) Ultratunna sektioner uppsamlas med användning av en ultramikrotom. 6) Tunna sektioner avbildas på ett transmissionselektronmikroskop. 7) Bild insamling och analys utförs blint med avseende på tidpunkter eller genotyper. Cellulära dynamik kan bestämmas genom rekonstruktion av tidsupplösta bilder 17, 18. Provberedning (steg 2-5 ovan) kräver en vecka, men den efterföljande bildanalys kräver månader till ett år.
"Flash-och frysning" tillvägagångssätt visualiserar membrandynamiken genom att inducera en specifik cellulär händelse med optogenetik och genom frysning celler vid definierade tidpunkter efter stimulering 19. I denna demonstration använde vi channelrhodopsin, en ljuskänslig katjonkanal, för att stimulera nervceller och fångade fusion och återvinning av synaptiska vesiklar vid de synaptiska ändarna. Under de senaste åren har många optogenetic verktyg tagits fram 22, 23, som alla är kompatibla med blixt och skyddsmedel. Till exempel, kan organell trafficking induceras med användning av Ijusinducerad heterodime av kryptokrom och CIB1 24. På liknande sätt kan lipidkompositionen av plasmamembranet förändras genom ljustranslokation av fosfoinositid fosfataser till plasmamembranet 25. Dessutom små, ljuskänsliga föreningar såsom azobensen change konforma beroende på belysningsvåglängder. Denna konformationsförändring kan användas för att aktivera ligandreglerade kanaler eller för att ändra lipidkomposition i membranet 26, 27. Caged föreningar kan också användas för att inducera cellulär aktivitet. Emellertid kan LED som används i den aktuella installationen inte producerar tillräcklig energi för uncaging; sålunda ytterligare optimeringar av systemet är sannolikt nödvändigt. Ändå tillämpningar av dessa ljus aktiverbara verktyg är flexibla många cellulära händelser kan framkallas av en ljusblixt. "Flash-and-freeze" kan fånga de resulterande membrandynamiken.
Det finns två huvudsakliga begränsningar i "flash-and-freeze" -metoden. Först fångar den "ögonblicksbilder" av en viss händelse från olika celler. Med andra ord är det inte möjligt att följa membrandynamiken i en cell under en tidsperiod. Således för återuppbyggnaden av någon cellulär ävent, måste man förvärva och analysera ett stort antal bilder från varje prov och vid varje tidpunkt. Vidare, i neuroner, är en ännu större antal bilder är nödvändigt, eftersom fusion av synaptiska vesiklar tar bara platser i 20 – 30% av synapserna i mus hippocampusneuroner 18, 28. Analysen av en så stor datamängd kräver enorma mängder tid. I framtiden bildtagning och analys måste automatiseras för att göra strategin mer effektiv 29, 30.
Den andra begränsning föreligger av naturen hos högtrycksfrysningsteknik. När celler frysa, omlagras cellulär vatten för att bilda iskristaller om fryshastigheten är lägre än 100 K / s 21. Dessa iskristaller kan penetrera membraner eller koncentrera lösta ämnen för att ändra lokala osmotiskt tryck, vilket resulterar i ruptur av membran. För att undvika iskristaller, HIGh tryck (~ 2000 atm) appliceras på provstyckena. På grund av den super-kylningseffekten, är tillräcklig för att förhindra vatten från att bilda iskristaller vid detta tryck 21 en fryshastighet av 100 K / s. I teorin, exemplar så tjockt som 500 | im kan frysas utan iskristaller, men cirka 200 ^ m är sannolikt den praktiska gränsen, såsom kuboidala former av is tenderar att bildas i tjocka vävnad, kompromissa morfologi. Vid bearbetning av prover tjockare än 5 pm, är det nödvändigt att använda en ordentlig kryo-skyddsmedel, såsom BSA. Emellertid kommer BSA ändra lösningens osmolaritet och kan påverka det fysiologiska svaret av celler. Därför är omfattande kontrollexperiment som krävs för att validera användning av BSA i speciella system. Iskristaller kan också bilda efter högtrycks frysning om provbitarna av misstag avlägsnas från bad med flytande kväve. Sålunda är det kritiskt att hålla prover i flytande kväve vid alla tidpunkter och för att använda i förväg kylda pincett tillmanipulera dem.
När du planerar experiment bör följande tre punkter övervägas. För det första är den maximala intensiteten av ljus (den 460 nm-linjen) 5,5-8,0 mW / mm 2. Huruvida denna intensitet är tillräcklig för att inducera aktivitet måste verifieras med levande-cell imaging på ett fluorescensmikroskop före blixt-och-frys experiment. För det andra måste experiment utföras vid fysiologisk temperatur. Stadiet högtrycks frys uppvärmes till 37 ° C under försöken med mus hippocampusneuroner 31. Slutligen måste tidpunkter noggrant valt att fånga membrandynamiken. Inledande studier visade att endocytos är fullständig efter 100 ms av stimulering. Sålunda, ytterligare tre tidpunkter (15, 30, & 50 ms) undersöktes också för att följa membrandynamiken 17, 18. Dessa tidpunkter var nödvändiga för att visualisera membran trafficking händelses under synaptisk transmission. Men kravet på antalet tidpunkter är olika i varje cellulär händelse. Därför bör några tidpunkter samplas före initiering stora dataset samling.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från Johns Hopkins University (SW). Vi tackar Johns Hopkins School of Medicine Mikroskop Facility för deras tekniska support. Vi tackar Erik Jorgensen och Christian Rosenmund och deras laboratorier för utveckling av tekniken. Vi tackar M. Wayne Davis för utformningen av den ursprungliga enheten. Vi tackar Paul Wurzinger, Cveta Tomova och Delgermaa Luvsanjav för deras tekniskt bistånd. Vi vill också tacka Natalie R. Hamilton och Grant F. Kusick för deras kritisk läsning av manuskriptet.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |