설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석
Summary
인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.
Abstract
유전학 및 시스템 생물학 기술에 있는 최근 어드밴스는 분자 수준에 말라리아 기생충의 생물학의 우리의 이해를 승진시켰습니다. 그러나, 백신 및 화학요법 발달을 위한 효과적인 말라리아 기생충 표적은 아직도 제한됩니다. 이것은 주로 인간 Plasmodium 종에 대한 관련및 실용적인 생체 내 감염 모델의 가용성, 특히 P. falciparum 및 P. vivax에대한 가용성 때문입니다. 따라서, 설치류 말라리아 종은 말라리아 백신, 약물 표적화, 면역 반응 및 보존된 Plasmodiumspp. 유전자의 기능적 특성화 연구를 위한 생체내 모델로 광범위하게 사용되어 왔다. 실제로, 설치류 말라리아 모형은 특히 모기 전송 및 간 단계 생물학을 탐구를 위해 귀중한 것으로 입증되고, 면역학 연구 결과를 위해 필수적이었습니다. 그러나, 형질전환 및 야생형 무성 및 성혈액 기기생충의 표현형을 평가하는 데 사용되는 방법에는 불일치가 있다. 이러한 불일치의 예로는 혈액 단계 기생충을 가진 설치류의 정맥 내 감염 과 남성 gamete exflagellation의 평가의 선택입니다. 본 명세서에서, 우리는 리포터 유전자 또는 야생형 설치류 말라리아 기생충 종을 발현하는 형질전환 기생충에서 무성 및 성혈액 단계의 표현형을 평가하기 위한 표준화된 실험 방법을 상세히 설명한다. 우리는 또한 Anopheles 모기 벡터 안쪽에 말라리아 기생충 모기 단계 (gametes, ookinetes, oocysts 및 sporozoites)의 표현형을 평가하는 방법을 상세히 설명합니다. 이러한 방법은 P. berghei 및 P. yoelii의 치명적이고 비 치명적인 균주에 대해 여기에서 상세하고 단순화되지만 P. chabaudi 및 P. vinckei 설치류 말라리아 종에 대한 일부 조정으로도 적용 될 수 있습니다.
Introduction
말라리아 기생충은 인간에 있는 말라리아 감염의 수억을 세계전반 일으키는 원인이 되고,이상 600,000의 죽음과 함께 매년 1. 인간적인 감염은 5개의 말라리아 기생충 종, 즉 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P.말라리아, 및 P. knowlesi에기인합니다. 대부분의 임상 말라리아 사망자는 사하라 사막 이남의 아프리카에서 P. falciparum에 의해 발생1. 사하라 사막 이남의 아프리카 외부광범위 한 세계적인 이환을 일으키는 원인이 되는 또 다른 인간적인 말라리아 기생충 종은 P. vivax2입니다. 다른 세 종은 모두 더 지리적으로 제한되고 치명적인 P. knowlesi3를 제외하고 양성 말라리아 감염을 일으킵니다. 감염의 관련되고 실제적인 비 인간 적인 모형의 가용성은 항상 이고 아직도 말라리아 백신 및 약 발달에 장애물입니다. 이전 말라리아 약 표적화 및 신진 대사 연구 결과는 P. gallinaceum 및 P. lophurae같이 조류 말라리아 모형에 광범위하게, 닭과 오리를 감염시키는, 각각4. 그 후, 설치류 말라리아 종은 생체 내 모델로서 다양한 백신 및 약물 표적 연구에서 점차적으로 도입되었다. 수년에 걸쳐, 인간 말라리아 종에 설치류 말라리아 모형의 생활 주기 단계의 생물학 그리고 호스트 기생충 상호 작용의 유사성의 기록이 축적되었습니다.
특히, 설치류 말라리아 모델은 모기의 생물학을 탐구하고 특성화하는 것이 매우중요했으며 적혈구 전 단계 5. 그러나, 4개의 설치류 말라리아 종(P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi,및 P. vinckei)이다른생물학적 특징을 가지며, 그 중 가장 주목할 만한 것은 혈액 단계 6에 있다. 설치류 말라리아 종은 혈액 단계의 동시성에 차이가, 어디 P. chabaudi와 P. vinckei 균주의 혈액 단계는 대부분 동기, P. berghei와 P. yoelii의 혈액 단계는 하지 않습니다 하는 동안6 , 7. 또 다른 주목할만한 차이점은 일부 균주에서 발생하는 혈액단계의 자기 정리입니다 (예를 들어, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 및 P. vinckei lentum),다른 사람의 혈액 감염에 대한 경우 동일한 종의 균주는 치료되지 않은 상태로 방치하면 치명적일 수 있습니다(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA 및 P. chabaudi AS). 더욱이, P. yoelii 17X-NL 균주 및 P. 베르게이 ANKA 균주는 P의 이러한 특징이 있지만, 우선적으로 망상 세포 8,9,10,11을침범한다. yoelii 및 P. berghei 균주는 엄격한 성장 요구 사항이 아니다12,13,14. 따라서, 마우스는 P. berghei ANKA 균주와 P. yoelii에 대한 모기 감염에 필요한 기생충 및 gametocytemia를 증가시키기 위해 그 기생충의 혈액 단계로 감염하기 전에 페닐히드라진으로 치료된다. 17X-NL15,16,17,18,19.
모기 단계 발달의 차이는 또한 다른 설치류 말라리아 종 사이에서 존재하며, 가장 주목할만한 것은 최적의 모기 단계발달과 스포로조이트 길이 5,6에필요한 온도와 시간입니다. 20. 설치류 말라리아 종의 사전 적혈구 단계에서, 차이는 감염성 포자형 접종에 가장 취약 설치류 종과 균주를 포함, 영향을 받기 쉬운 설치류 균주에서 접종에 필요한 포자 형화물의 수, 체외 간 단계 발달 에 필요한 포유류 세포 유형, 및 간단계 발달을 완료하는 시간 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
이러한 가변성에도 불구하고, 설치류 말라리아 기생충은 역유전적 접근법의 적용을 위해 초기에 유리한 모델이었으며, 성공 확률이높은 31보다 적은 시간과 자원소비가 적기 때문이다. 사실, 설치류 말라리아 모형은 제일 모형이고, 많은 경우에 유일한 모형은, 기능적으로 모기와 간 단계에서 표현된 유전자를 특성화하기 위하여 수년간 유효합니다.
설치류 말라리아 모형에 있는 역유전 접근의 대중성과 구역성에 비추어, 다른 방법론은 형질전환 기생충 생활 주기 단계, 특히 혈액 단계의 표현형을 분석하기 위하여 이용되었습니다. 그러나 이러한 방법론 중 일부는 일치하지 않습니다. 예를 들어, IP 주입 다음 혈액 단계 기생충의 감염을 비교 (이는 아마도 후막 림프절에 배수하고, 거기에서, 혈류를 입력 할 수 있습니다; 따라서, 주입 된 기생충은 혈류량에서 동등하게 끝나지 않는다) , 일련 혈액 단계 전송 또는 G 번호의 다른 번호와 클론의 모기 전송을 비교 (이는 gametocytogenesis에 영향을 미칠 수32,33),또는 순진한 야생 유형에 직접 형질 전환 기생충을 비교 (WT) 전형및 양성 약물 선택 및 남성 gamete exflagellation의 각종 표준화되지 않은 평가를 결코 겪지 않았던 기생충. 따라서, 설치류 말라리아의 생물학적 가변성을 수용하기 위해 혈액과 모기에 있는 모든 유형의 형질전환 또는 WT 설치류 말라리아 기생충의 표현형 분석을 위해 따르기 위하여 따르기 위하여 간단한 프로토콜을 표준화하는 것이 중요합니다 기생충 종.
본 명세서에서, 우리는 형질전환 형 또는 야생형 P. yoelii 및 P. berghei 기생충의 혈액 및 모기 수명 주기 단계의 표현형 분석을 위한 표준화되고 상세한 실험 프로토콜에 보고한다. 이들 프로토콜은 또한 P. 차보디 및 P. 빈케이 기생충에 적용 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 말라리아 기생충의 그것과 그들의 생활 주기의 일반적인 생물학에 있는 유사성에도 불구하고, 마우스 말라리아 모형은 또한 생체 내 모형에서 믿을 수 있는 그들의 사용을 제한하는 인간 적인 Plasmodium 종에 많은 유사점이 있습니다. 예를 들면, 백신으로 살아있는 감쇠한 기생충을 제외하고, 소단위와 DNA 및 그밖 백신을 가진 모든 백신 연구 결과는 마우스 모형에 있는 우수한 결…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아메드 Aly는 개발 보조금의 터키 정부에서 Bezmialem Vakif 대학에 자금 지원 2015BSV036, 공중 보건 및 열대 의학의 툴레인 대학 학교에서 제공하는 자금으로, R21Grant에 대한 NIH-NIAID에서 자금지원 1R21AI11058-01A1.
Materials
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
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