Фенотипический анализ грызунов малярии паразита асексуальных и сексуальной крови этапов и комаров этапов

Summary

Из-за поразительного сходства жизненного цикла и биологии малярийных паразитов грызунов с малярийными паразитами для человека модели малярии, модели малярии грызунов стали незаменимыми для исследований малярии. В этой области мы стандартизировали некоторые из наиболее важных методов, используемых в фенотипическом анализе видов малярии дикого типа и трансгенного грызунов.

Abstract

Недавние достижения в области генетики и технологий системной биологии способствовали нашему пониманию биологии малярийных паразитов на молекулярном уровне. Однако эффективные цели малярийного паразита для вакцинации и развития химиотерапии по-прежнему ограничены. Это в значительной степени связано с отсутствием соответствующих и практических моделей инфекции in vivo для человека Plasmodium видов, в первую очередь для P. falciparum и P. vivax. Таким образом, виды малярии грызунов широко используются в качестве практической альтернативы in vivo моделям вакцины против малярии, таргетинга лекарств, иммунного ответа и функциональных исследований характеристик сохраненных Plasmodiumspp. Действительно, модели малярии грызунов оказались бесценными, особенно для изучения биологии передачи комаров и печеночной стадии, и были незаменимы для иммунологических исследований. Однако существуют расхождения в методах, используемых для оценки фенотипов трансгенных и диких асексуальных и сексуальных паразитов на стадии крови. Примерами таких расхождений являются выбор внутривенной против интраперитонеальной инфекции грызунов с паразитами на стадии крови и оценка мужского гаметного раздражения. В этом материале мы подробно описываем стандартизированные экспериментальные методы оценки фенотипов асексуальных и половых стадий крови у трансгенных паразитов, выражающих характер репортера-гена или диких видов малярийных паразитов типа. Мы также подробно методы оценки фенотипов малярийных паразитов комаров этапов (гаметы, ookinetes, ооцисты, и sporozoites) внутри Anopheles комаров переносчиков. Эти методы подробно и упрощены здесь для смертоносных и нелетальных штаммов P. berghei и P. yoelii, но также могут быть применены с некоторыми корректировками на P. chabaudi и P. vinckei грызунов видов малярии.

Introduction

Малярийные паразиты вызывают сотни миллионов случаев инфицирования малярией среди людей вовсем мире, при этом ежегодно происходит более 600 000 случаев смерти. Инфекции человека вызваны пятью видами малярийных паразитов, а именно: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeи P. knowlesi. Большинство клинических случаев смерти от малярии вызваны P. falciparum в странах Африки к югу от Сахары¹. Другой вид паразитов малярии человека, который вызывает обширные заболевания во всем мире за пределами Африки к югу от Сахары является P. vivax². Остальные три вида все более географически ограничены и вызывают доброкачественные инфекции малярии, за исключением смертельных P. knowlesi³. Отсутствие соответствующих и практических нечеловеческих моделей инфекций всегда было и остается препятствием для разработки вакцины против малярии и разработки лекарственных средств. Ранее малярийных наркотиков ориентации и метаболических исследований широко опирались на модели птичьей малярии, как P. gallinaceum и P. lophurae, заражая кур и уток, соответственно⁴. После этого виды малярии грызунов постепенно внедрялись в различные вакцины и исследования по таргетированию лекарственных средств в качестве моделей in vivo. На протяжении многих лет, доказательства сходства биологии и принимающей паразитов взаимодействия жизненного цикла этапов моделей малярии грызунов с человеческими видами малярии накопились.

В частности, модели малярии грызунов были чрезвычайно важны для изучения и характеристики биологии комаров и доэритроцитных стадий⁵. Тем не менее, Есть четыре вида малярии грызунов(P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, и P. vinckei), которые имеют различные биологические особенности, наиболее заметные из которых находятся в стадии крови⁶. Виды малярии грызунов отличаются синхронностью стадий крови, где стадии крови штаммов P. chabaudi и P. vinckei в основном синхронны, в то время как стадии крови P. berghei и P. yoelii не^{6 , 7}. Еще одним заметным отличием является самоочистка стадий крови, которая происходит в некоторых штаммов (например, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, и P. vinckei lentum), в то время как инфекция крови других штаммы одного и того же вида могут быть смертельными, если не лечить(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, и P. chabaudi AS). Кроме того, P. yoelii 17X-NL штамм и P. berghei ANKA штамм преимущественно вторгнуться ретикулоцитов^8,9,10,11, хотя эти особенности П. yoelii и P. berghei штаммы не являются строгим требованием роста^12,13,14. Таким образом, мышей лечат фенилгидразином до заражения с стадиями крови этих паразитов для увеличения паразитмии и гаметоцитемии, необходимой для инфекции комаров для штамма P. berghei ANKA и для P. yoelii 17X-NL^{15,16,17,18,19}.

Различия в развитии комаров этапов также существуют среди различных видов малярии грызунов, наиболее заметными являются температура и время, необходимое для оптимального развития комаров этапов и sporozoite длина^{5,6, 20}. В доэрроцитических стадиях видов малярии грызунов, различия включают грызунов видов и штаммов, которые наиболее восприимчивы к инфекционным прививка сопорозоита, количество sporozoites, необходимых для прививки в восприимчивый штамм грызунов, типы клеток млекопитающих, необходимые для анализа стадии развития печени in vitro, и время для завершения развития стадии печени^{5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30}.

Несмотря на эти изменчивости, грызуны малярии паразитов были благоприятными моделями на раннем этапе для применения обратных генетических подходов, потому что они были менее времени и ресурсоемких с высокой вероятностью успеха³¹. В самом деле, модели малярии грызунов были лучшими моделями, и во многих случаях только модели, доступные в течение многих лет, чтобы функционально охарактеризовать гены, выраженные в комаров и печени этапов.

В свете популярности и удобства обратных генетических подходов в моделях малярии грызунов, для анализа фенотипов трансгенного цикла жизни паразитов, особенно стадий крови, был использован ряд различных методологий. Однако некоторые из этих методологий несовместимы; например, сравнение инфекций паразитов на стадии крови после инъекции ИС (которые, возможно, осушаются в перитонеальные лимфатические узлы и, оттуда, могут попасть в кровоток; следовательно, инъекционные паразиты не попадают в равной степени в кровоток) , сравнение передачи комаров клонов с различным числом серийных передач крови стадии или G номер (который может повлиять на gametocytogenesis^32,33), или сравнение трансгенных паразитов непосредственно наивный дикий тип (WT) паразитов, которые никогда не подвергались электропорации и положительного отбора наркотиков и различных нестандартизированных оценок мужского гамета exflagellation. Поэтому крайне важно стандартизировать протоколы, которые просто следовать для фенотипического анализа любого типа трансгенных или WT грызунов малярии паразитов в крови и в комаров для размещения для биологической изменчивости грызунов малярии видов паразитов.

При этом мы сообщаем о стандартизированном, детальном экспериментальном протоколе для фенотипического анализа стадий жизненного цикла крови и комаров трансгенных или диких паразитов P. yoelii и P. berghei. Эти протоколы также применимы к паразитам P. chabaudi и P. vinckei.

Protocol

Все описанные здесь эксперименты на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Тулейнского университета и комитета по этике животных Университета Безмиалем аклиф. Все остальные экспериментальн…

Representative Results

Успех применения обратных генетических инструментов и методов для малярии паразитов произвел революцию в области исследований малярии, с возможностью добавить, удалить или изменить конкретные геномные сегменты нескольких видов Plasmodium 39. Важно отме?…

Discussion

Несмотря на сходство в общей биологии их жизненных циклов с моделями малярии человека, модели малярии мыши также имеют много разнородности к видам плазмодия человека, которые ограничили бы их использование в качестве надежных моделей in vivo. Например, за исключением живых пара?…

Materials

Heparin	Sigma	375095-100KU
Xanthurenic acid	Sigma	D120804-5G
Hypoxanthine	Sigma	H9377-25G
Alsever's solution	Sigma	A3551-500ML
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Phenylhydrazine	Sigma	P26252-5G
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
Giemsa	Sigma	GS1L-1L
26G x 3/8 Precision Glide Needle,	Becton Dickinson	305110
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8	Becton Dickinson	309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G	Becton Dickinson	329412
Isoflurane, USB	Piramal	2667- 46- 7
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
RPMI	Gibco	22400105
DMEM	Gibco	11995065
Pencillin/ Streptomycin	Gibco	10378016
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147
Fiber Glass Wool	Corning	3950