Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi
Summary
İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.
Abstract
Genetik ve sistem biyoloji teknolojilerinde yapılan son gelişmeler, sıtma parazitlerinin biyoloji anlayışımızı moleküler düzeyde teşvik etmiştir. Ancak, aşı ve kemoterapi gelişimi için etkili Sıtma paraziti hedefleri hala sınırlıdır. Bu büyük ölçüde insan Plasmodium türleri için ilgili ve pratik in vivo enfeksiyon modellerinin olmaması nedeniyle, en önemlisi p. falciparum ve p. vivaxiçin. Bu nedenle, kemirgen sıtma türleri yaygın olarak sıtma aşısı, ilaç hedefleme, bağışıklık tepkisi ve korumalı Plasmodiumspp. genes fonksiyonel karakterizasyon çalışmaları için pratik alternatif olarak vivo modeller olarak kullanılmıştır. Nitekim, kemirgen sıtma modelleri, özellikle sivrisinek iletim ve karaciğer sahne biyoloji keşfetmek için, paha biçilemez olduğu kanıtlanmıştır ve immünolojik çalışmalar için vazgeçilmez idi. Ancak, transgenik ve vahşi tip aseksüel ve cinsel kan aşamasında parazitlerin fenotipleri değerlendirmek için kullanılan yöntemlerle farklılıkları vardır. Bu tutarsızlıkları örnekleri kan-sahne parazitleri ve erkek gamet exflagellation değerlendirilmesi ile kemirgenler intravenöz vs intraperitoneal enfeksiyon seçimdir. Burada, haberci-geni veya vahşi tip kemirgen Sıtma paraziti türlerini ifade eden transgenik parazitlerin aseksüel ve cinsel kan aşamalarında fenotipleri değerlendirmek için standartlaştırılmış deneysel yöntemler ayrıntılarıyla. Ayrıca, Anopheles sivrisinek vektörler içinde Sıtma paraziti sivrisinek aşamalarının (gametes, ookinetes, oocysts ve sporozoites) fenotipleri değerlendirmek için yöntemler ayrıntılarıyla. Bu yöntemler ayrıntılı ve burada p. berghei ve p. yoelii ölümcül ve ölümcül olmayan suşları için Basitleştirilmiş ama aynı zamanda p. chabaudi ve p. vinckei kemirgen sıtma türleri bazı ayarlamalar ile uygulanabilir.
Introduction
Sıtma parazitleri insanlar dünya çapında sıtma enfeksiyonları yüzlerce milyonlarca neden, 600.000 ‘ den fazla ölüm her yıl1. İnsan enfeksiyonları beş Sıtma paraziti türünün neden olduğu, yani p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, ve p. knowlesi. Çoğu klinik sıtma mortaliteleri, Sahra-altı Afrika ‘da P. falciparum ‘dan kaynaklanır1. Sahra-altı Afrika dışında geniş dünya çapında morbiditelerin neden olduğu başka bir insan Sıtma paraziti türü P. vivax2‘ dir. Diğer üç tür daha coğrafik olarak sınırlıdır ve ölümcül P. knowlesi3hariç, benign sıtma enfeksiyonlarına neden olmaktadır. Enfeksiyonların ilgili ve pratik olmayan-insan içinde vivo modellerin bulunabilirliği her zaman olmuştur ve hala sıtma aşısı ve ilaç gelişimi için bir engeldir. Daha önce sıtma ilaç hedefleme ve metabolik çalışmalar, sırasıyla4tavuk ve ördek enfekte p. gallinaceum ve p. lophuraegibi kuş sıtma modellerinde kapsamlı olarak güvendi. Bundan sonra, kemirgen sıtma türleri kademeli olarak çeşitli aşılar ve ilaç hedefleme çalışmalarında in vivo modelleri olarak tanıtıldı. Yıllar içinde, biyoloji ve ev sahibi-parazit etkileşimlerini insan sıtma türleri için kemirgen sıtma modellerinin yaşam döngüsü aşamalarında benzerliklerin kanıtı birikmiştir.
Özellikle, kemirgen sıtma modelleri sivrisinek ve ön eritrositik aşamaların biyolojisini keşfetmek ve karakterize etmek için son derece önemliydi5. Ancak, dört kemirgen sıtma türü vardır (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, ve p. vinckei) farklı biyolojik özelliklere sahip, en önemli olan kan aşamalarında6. Kemirgen sıtma türleri kan aşamalarında eşzamanlılık farklıdır, p. chabaudi ve p. vinckei suşlarının kan aşamaları çoğunlukla senkron, p. berghei ve p. yoelii kan aşamaları6 değildir iken , 7. başka bir önemli fark, bazı suşları (örn., p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65 ve p. vinckei lentum) meydana gelen kan aşamalarının Self-boşluk, diğer kan enfeksiyonu ise aynı türlerin suşları (p. yoelii 17x-L, p. berghei Anka, ve p. chabaudi as) tedavi edilmemiş sol ölümcül olabilir. Dahası, p. yoelii 17x-nl strain ve p. berghei Anka gerinim tercihen retikülositler istila8,9,10,11, bu özellikleri rağmen P. yoelii ve P. berghei suşları sıkı bir büyüme gereksinimi12,13,14değildir. Bu nedenle, fareler, p. berghei Anka gerinim ve p. yoelii için bir sivrisinek enfeksiyonu için gerekli olan parasitemia ve gametocytemia artırmak için bu parazitlerin kan aşamaları ile enfeksiyondan önce fenilhidrazinsülfonik ile tedavi edilir 17x-nl15,16,17,18,19.
Sivrisinek aşamaları gelişimi farklılıkları da farklı kemirgen sıtma türleri arasında var, en önemli sıcaklık ve zaman optimum sivrisinek aşamaları gelişimi ve sporozoit uzunluğu için gerekli olan5,6, 20‘ ye kadar. Kemirgen sıtma türlerinin ön eritrositik aşamalarında, farklılıklar bulaşıcı sporozoit aşı en duyarlı kemirgen türler ve gerinim dahil, duyarlı kemirgen gerinim içinde aşı için gerekli sporozoitler sayısı, In vitro karaciğer sahne gelişimi için gerekli olan memelinin hücre tipleri ve karaciğer sahne gelişimini tamamlama zamanı5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Bu değişkenlere rağmen, kemirgen sıtma parazitleri ters genetik yaklaşımların uygulanması için erken olumlu modeller vardı, çünkü onlar daha az zaman-ve başarı yüksek bir olasılık ile kaynak tüketen31. Aslında, kemirgen sıtma modelleri en iyi modeller vardı, ve birçok durumda sadece modelleri, işlevsel bir şekilde genleri sivrisinek ve karaciğer aşamalarında ifade niteleştirmek için kullanılabilir.
Kemirgen sıtma modellerinde ters genetik yaklaşımlar popülerlik ve amenability ışığında, farklı metodolojileri bir dizi transgenik parazitin yaşam döngüsü aşamalarında fenotipleri analiz etmek için kullanılmıştır, özellikle kan aşamaları. Ancak, bu metodolojilerin bazıları tutarsız; Örneğin, bir IP enjeksiyonu sonrasında kan-aşama parazitlerinin enfeksiyonlarını karşılaştırarak (muhtemelen periton lenf nodlarına boşaltılır ve oradan kan dolaşımına girebilir; bu nedenle, enjekte edilen parazitler kan dolaşımında eşit olarak sona ermez) , farklı sayıda seri kan-aşama transferleri veya G numarası ile klonların sivrisinek iletimi karşılaştırarak (hangi gametocytogenesis32etkileyebilir,33), ya da doğrudan saf vahşi tip (WT) transjenik parazitler karşılaştırarak Elektroporasyon ve pozitif ilaç seçimi ve erkek gamet exflagellation çeşitli standartlaştırılmış değerlendirmeleri maruz asla parazitler. Bu nedenle, kan içinde transgenik veya WT kemirgen sıtma parazitleri her türlü fenotipik analizi için takip etmek basit protokolleri standartlaştırmak etmek için çok önemlidir ve sivrisinek içinde kemirgen sıtma biyolojik varyasyon için karşılamak için parazit türleri.
Bu belgede, transjenik veya vahşi tip p. yoelii ve p. berghei parazitlerinin kan ve sivrisinek yaşam döngüsü aşamalarının fenotipik analizi için standardize edilmiş, detaylı deneysel bir protokol bildiriyoruz. Bu protokoller de p. chabaudi ve p. vinckei parazitleri için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan sıtma parazitleri onların yaşam döngüleri Genel Biyoloji benzerlik rağmen, fare sıtma modelleri de güvenilir in vivo modelleri olarak kullanımını sınırlamak olacak ınsan Plasmodium türleri için pek çok benzerlik vardır. Örneğin, aşılar olarak canlı zayıflatılmış parazitlerin dışında, altbirim ve DNA ve diğer aşılar ile tüm aşı çalışmaları fare modelinde mükemmel sonuçlar verdi, ancak endemik bölgelerde yaşayan insanlarda, sonuçlar tatmin edici değildi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ahmed aly, Türkiye Kalkınma Bakanlığı Grant 2015BSV036 ‘ dan Bezmialem vakif Üniversitesi ‘ne finansman sağlayarak ve Tulane Üniversitesi Kamu Sağlığı ve tropikal Tıp Fakültesi tarafından sağlanan finansman ve R21Grant için NIH-NIAID ‘ e fon vererek desteklenmektedir. 1R21Aı111058-01A1.
Materials
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi–zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B., Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here?. Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel ‘gene insertion/marker out’ (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
