Vurdering af hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved anvendelse af Golgi-Cox-metoden
Summary
Her præsenterer vi en Golgi-Cox-protokol i omfattende detaljer. Denne pålidelige vævsbestemmelsesmetode giver mulighed for en højkvalitetsvurdering af cytoarkitekturen i hippocampus og i hele hjernen, med minimal fejlfinding.
Abstract
Dendritiske spines er fremspringene fra de neuronale dendritiske aksler, der indeholder excitatoriske synapser. De morfologiske og forgreningsvariationer af de neuronale dendritter inden for hippocampus er impliceret i kognition og hukommelsesdannelse. Der er flere tilgange til Golgi-farvning, som alle har været nyttige til bestemmelse af de morfologiske egenskaber ved dendritiske arbors og frembringer en klar baggrund. Den nuværende Golgi-Cox-metode (en lille variation af protokollen, der er forsynet med et kommercielt Golgi-farvningssæt), blev designet til at vurdere, hvordan en relativt lav dosis af det kemoterapeutiske lægemiddel 5-flurouracil (5-Fu) ville påvirke dendritisk morfologi , Antallet af rygsøjler og kompleksiteten af arborisering inden for hippocampus. 5-Fu modulerede signifikant den dendritiske kompleksitet og nedsatte rygtætheden i hele hippocampus på en regionspecifik måde. De viste data viser, at Golgi-farvemetoden efFektively farvede de modne neuroner i CA1, CA3 og dentale gyrus (DG) i hippocampus. Denne protokol rapporterer detaljerne for hvert trin, så andre forskere pålideligt kan plette væv i hele hjernen med resultater af høj kvalitet og minimal fejlfinding.
Introduction
Dendritter er den største del af neuroner, der modtager og behandler presynaptisk input 1 . Deres dendritiske processer har en kompleks geometri, hvor de proximale grene har en større diameter end de distale grene. Som dendrit udvikler, danner de flere forbindelser med andre neuroner i en proces, der kaldes dendritisk arborisering. Omfanget og mønsteret af denne forgrening bestemmer mængden af synaptiske input, som en dendrit kan behandle tilstrækkeligt 2 .
Dendritisk arborisering er en nødvendig proces for aktivitetsafhængig plasticitet og korrekt udvikling af neuronalkredsløb. Forlængelse, tilbagetrækning, forgrening og synaptogenese er indviklede processer, der indbefatter indre genetiske programmer og påvirkninger fra ekstrinsiske faktorer. De morfologiske og forgreningsvariationer af de neuronale dendritter i hippocampus er impliceret i kognition og hukommelsesdannelseF "> 3 , 4. Ændringer i dendritisk kompleksitet er forbundet med patofysiologiske og adfærdsmæssige ændringer 5. Abnormaliteter er relateret til flere sygdomstilstande, herunder Fragile X Syndrome og Down Syndrome 6 .
Dendritiske spines er de specialiserede subcellulære rum af de dendritiske arbors, der modtager excitatorisk indgang i centralnervesystemet. Der er tre morfologiske klasser af dendritiske rygsøjler med navnet på hver klasse baseret på deres størrelse og form: 1) svampespidser, som har komplekse postsynaptiske densiteter med flere glutamatreceptorer end andre rygsøjler 7 ; 2) Stumpede rygsøjler, der mangler en stamme; Og 3) tynde rygsøjler, der består af en langstrakt smal stamme og et kugleformet hoved 8 . Dendritisk rygsøjlevolumen anvendes til dels til at definere dem, med tynde rygsøjler generelt mindre (0,01 μm 3 </sup>) Sammenlignet med svampespidser (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Spinesne stabiliseres med modning. For eksempel trækkes de tynde rygsøjler enten tilbage efter nogle få dage eller udvikler sig til svampespidser. Alternativt er svampespidserne relativt stabile og kan overleve i en længere periode. Styrken af de neuronale forbindelser antages at være baseret på antallet af rygsøjler og / eller deres volumen 11 , 12 , 13 .
Den klassiske Golgi-farvningsmetode og dens mere moderne variationer har alle været nyttige til undersøgelse af dendritisk ryggradsmorfologi og densitet. Et unikt aspekt ved Golgi-farvningen er, at det tilfældigt pletter omkring 5% af de samlede neuroner, hvilket muliggør sporing af individuelle neuroner 14 , 15 . Selvom den præcise mekanisme, hvori Golgi methOd pletter individuelle neuroner er stadig ukendt, princippet for metoden er baseret på krystallisation af sølvkromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Der er tre hovedtyper af Golgi-metoden: den hurtige Golgi, Golgi-Cox og Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle tre metoder starter med en indledende inkubationsfase i chromsalte i flere dage til måneder, men der er visse vigtige forskelle mellem dem. Den hurtige Golgi bruger osmiumtetroxid i første trin, mens Golgi-Kopsch indbefatter paraformaldehyd. Farvningen i både den hurtige Golgi og Golgi-Kopsch efterfølges af en inkubation i en 1-2% sølvnitratopløsning i ca. 7 dage. Golgi-Cox-metoden anvender mercuricchlorid og kaliumdichromat i stedet for sølvnitrat og har en imprægneringstid på 2-4 uger. Vævene er derefter snittet og hurtigt anbragt i en fortyndet ammoniakOpløsning efterfulgt af en fotografisk fixer til fjernelse af salte. Af de tre typer anses Golgi-Cox-metoden at være den bedste til farvning af de dendritiske arbors uden meget baggrundsinterferens, dels fordi krystalgenstande ikke forekommer på vævens overflade (i modsætning til i den hurtige Golgi-metode) 17 , 20 , 21 .
Den foreliggende metode er en lille variation af protokollen forsynet med et kommercielt Golgi-farvningskit og blev designet til at vurdere, hvordan en relativt lav dosis af 5-Fu ville påvirke de dendritiske morfologiske egenskaber og rygsøjletætheden. Enhver indhentet data kunne give yderligere indsigt i, hvordan kemoterapeutisk behandling påvirker neuronalkredsløbet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med mere moderne teknikker har Golgi-Cox-metoden flere fordele, der gør den til den foretrukne metode til undersøgelse af rygmorfologi: 1) Farvningen kan anvendes til i det væsentlige ethvert væv, 2) Et grundlæggende lysmikroskopopsætning er alt, hvad der er nødvendigt for at Erhverve Golgi-baserede billeder, 3) Golgi-Cox-billeddannelsen er hurtigere end konfokal billeddannelse, og 4) Golgi-farvede sektioner er levedygtige i flere måneder til år længere end prøver, der er fluorescensmærkede. Sel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et pilotstipendium under NIH P20 GM109005 (ARA) og af Center for Oversættelses Neurovidenskab IDeA-programprisen P30 GM110702.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neurosciences. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the “selectivity” of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The “single” section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- . Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123 Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000)
- . . Neurolucida 11.03. , (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neurosciences. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neurosciences. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
