Bedömning av hippocampal dendritisk komplexitet hos åldrade möss med användning av Golgi-Cox-metoden
Summary
Här presenterar vi ett Golgi-Cox-protokoll i stor detalj. Den här pålitliga vävnadsfärgsmetoden möjliggör en högkvalitativ bedömning av cytoarkitekturen i hippocampus, och genom hela hjärnan, med minimal felsökning.
Abstract
Dendritiska ryggraden är utskjutningarna från de neuronala dendritiska axlarna som innehåller excitatoriska synapser. De morfologiska och förgrenande variationerna av neuronaldenditerna inom hippocampus är inblandade i kognitions- och minnesbildning. Det finns flera tillvägagångssätt för Golgi-färgning, som alla har varit användbara för att bestämma de morfologiska egenskaperna hos dendritiska arbors och ge en klar bakgrund. Den nuvarande Golgi-Cox-metoden (en liten variation av protokollet som är försedd med ett kommersiellt Golgi-färgkit) var utformat för att bedöma hur en relativt låg dos av det kemoterapeutiska läkemedlet 5-flurouracil (5-Fu) skulle påverka dendritisk morfologi , Antalet spines och komplexiteten hos arborisering inom hippocampus. 5-Fu-modulen signifikant modulerade den dendritiska komplexiteten och minskade ryggradens densitet genom hippocampuset på ett regionspecifikt sätt. Uppgifterna visar att Golgi-färgmetoden efFektivt färgade de mogna neuronerna i CA1, CA3 och dentilgyrus (DG) hos hippocampusen. Detta protokoll rapporterar detaljerna för varje steg så att andra forskare på ett tillförlitligt sätt kan fläcka vävnad genom hjärnan med högkvalitativa resultat och minimal felsökning.
Introduction
Dendriter är den största delen av neuroner som tar emot och behandlar presynaptisk ingång 1 . Deras dendritiska processer har en komplex geometri, där de proximala grenarna har en större diameter än de distala grenarna. När dendriter utvecklas bildar de flera samband med andra neuroner i en process som kallas dendritisk arborisering. Graden och mönstret för denna förgrening bestämmer mängden synaptiska ingångar som en dendrit kan behandla tillräckligt 2 .
Dendritisk arborisering är en nödvändig process för aktivitetsberoende plasticitet och korrekt utveckling av neuronkretsar. Förlängning, retraktion, förgrening och synaptogenes är invecklade processer som innefattar inneboende genetiska program och influenser från extrinsiska faktorer. De morfologiska och förgreningsvariationerna av neuronaldenditerna inom hippocampus är inblandade i kognitions- och minnesbildningF "> 3 , 4. Ändringarna i dendritisk komplexitet är associerade med patofysiologiska och beteendemässiga förändringar 5. Abnormaliteter är relaterade till flera sjukdomstillstånd, inklusive bräckligt X-syndrom och ned-syndrom 6 .
Dendritiska spines är de specialiserade subcellulära facken hos de dendritiska arborsna som får excitatorisk inmatning i centrala nervsystemet. Det finns tre morfologiska klasser av dendritiska ryggraden, med namnet på varje klass baserat på storlek och form: 1) svampspinsar, som har komplexa postsynaptiska densiteter med mer glutamatreceptorer än andra ryggraden 7 ; 2) Stubbiga spines, som saknar en stam; Och 3) tunna ryggraden, som består av en långsträckt smal stam och ett globärt huvud 8 . Dendritisk ryggradsvolymen används delvis för att definiera dem, med tunna ryggraden i allmänhet mindre (0,01 μm 3 </sup>) Jämfört med svampspinar (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Ryggraden stabiliseras med mognad. Till exempel, de tunna ryggraden antingen dra sig tillbaka efter några dagar eller utvecklas till svampspines. Alternativt är svampspindlarna relativt stabila och kan överleva under en längre tid. Styrkan hos neuronala förbindelser antas vara baserad på antalet spines och / eller deras volymer 11 , 12 , 13 .
Den klassiska Golgi-färgmetoden och dess modernare variationer har alla varit användbara för att undersöka dendritisk ryggradsmorfologi och densitet. En unik aspekt av Golgi-färgningen är att den slumpmässigt fläckar omkring 5% av de totala neuronerna, vilket möjliggör spårning av enskilda neuroner 14 , 15 . Även om den exakta mekanismen som Golgi methOd fläckar enskilda neuroner är fortfarande okända, principen för metoden är baserad på kristalliseringen av silverkromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Det finns tre huvudtyper av Golgi-metoden: den snabba Golgi, Golgi-Cox och Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alla tre metoderna börjar med en initial inkubationsfas i kromsalter i flera dagar till månader, men det finns vissa viktiga skillnader mellan dem. Den snabba Golgi använder osmiumtetroxid i det första steget, medan Golgi-Kopsch innehåller paraformaldehyd. Färgningen i både den snabba Golgi och Golgi-Kopsch följs av en inkubation i en 1-2% silvernitratlösning under ca 7 dagar. Golgi-Cox-metoden använder kvicksilverklorid och kaliumdikromat istället för silvernitrat och har en impregneringstid på 2-4 veckor. Vävnaderna snittas sedan och placeras snabbt i en utspädd ammoniakLösning följt av en fotografisk fixerare för avlägsnande av salter. Av de tre typerna anses Golgi-Cox-metoden vara bäst vid färgning av de dendritiska arborerna utan stor bakgrundsinterferens, delvis, eftersom kristallartefakterna inte uppträder på ytan av vävnaden (till skillnad från i den snabba Golgi-metoden) 17 , 20 , 21 .
Föreliggande metod är en liten variation av protokollet som tillhandahålls med ett kommersiellt Golgi-färgkit och utformades för att utvärdera hur en relativt låg dos av 5-Fu skulle påverka de dendritiska morfologiska egenskaperna och ryggradens densitet. Alla förvärvade uppgifter kan ge ytterligare inblick i hur kemoterapeutisk behandling påverkar neuronalkretsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jämfört med modernare tekniker har Golgi-Cox-metoden flera fördelar som gör den till den föredragna metoden för att undersöka ryggradsmorfologi: 1) Färgningen kan användas för väsentligen vilken vävnad, 2) Ett grundläggande ljusmikroskopinställning är allt som behövs för att Förvärva Golgi-baserade bilder, 3) Golgi-Cox-avbildning är snabbare än konfokal avbildning, och 4) Golgi-färgade sektioner är genomförbara i flera månader till år längre än prover som är fluorescensmärkta. Även med des…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett pilotbidrag enligt NIH P20 GM109005 (ARA) och av Center for Translational Neuroscience IDeA-programpriset P30 GM110702.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neurosciences. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the “selectivity” of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The “single” section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- . Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123 Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000)
- . . Neurolucida 11.03. , (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neurosciences. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neurosciences. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
