Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.
Dendritik dikenler, eksitatör sinapslar içeren nöronal dendritik millerin çıkıntılarıdır. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilir. Golgi boyama için çeşitli yaklaşımlar vardır, bunların hepsi dendritik alandların morfolojik özelliklerini belirlemek ve belirgin bir arka plan oluşturmak için kullanışlıdır. Mevcut Golgi-Cox yöntemi (ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün ufak bir varyasyonu), kemoterapötik ilaç olan 5-flurouracil'in (5-Fu) nispeten düşük dozunun dendritik morfolojiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır , Omurganın sayısı ve hipokampüs içindeki işlenmesi karmaşıklığı. 5-Fu, dendritik karmaşıklığı önemli derecede modüle etti ve bölgeye özel bir şekilde, hipokampustaki omurga yoğunluğunu azalttı. Sunulan veriler, Golgi boyama yönteminin efOlgun nöronları, CA1, CA3 ve hipokampus diş açısı (DG) lekelemiştir. Bu protokol, diğer araştırmacıların beyne dokuları yüksek kaliteli sonuçlar ve minimum sorun giderme ile güvenilir şekilde boyayabilmesi için her adımın ayrıntılarını bildirir.
Dendritler, presinaptik girdi 1'i alan ve işleyen nöronların en büyük kısmıdır. Dendritik süreçleri, proksimal dalların distal dallardan daha büyük bir çapa sahip olduğu karmaşık bir geometriye sahiptir. Dendritler geliştikçe, dendritik arborizasyon olarak adlandırılan bir süreçte diğer nöronlarla birkaç bağlantı oluştururlar. Bu dallanma miktarı ve paterni, bir dendrite'nin 2'yi yeterince işleyebildiği sinaptik girdilerin miktarını belirler.
Dendritik koordinasyon, aktiviteye bağlı plastisite ve nöronal devrelerin düzgün gelişimi için gerekli bir süreçtir. Uzatma, geri çekme, dallanma ve sinaptojenez intrensek genetik programlar ve ekstrensek faktörlerden etkilenen karmaşık süreçlerdir. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilirF "> 3 , 4. Dendritik karmaşıklıktaki değişiklikler patofizyolojik ve davranışsal değişikliklerle ilişkilidir 5. Anormallikler Kırılgan X Sendromu ve Down Sendromu 6 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir.
Dendritik omurgalar, merkezi sinir sistemi içinde heyecan verici girdiler alan dendritik arbelerin uzmanlaşmış subselüler bölmeleridir. Dendritik dikenlerin üç morfolojik sınıfı vardır, her sınıfa boyutları ve şekilleri temel alınarak adı verilmiştir: 1) diğer dikenlere göre daha fazla glutamat reseptörü ile kompleks postsinaptik yoğunluklara sahip olan mantar dikenleri; 2) kökten yoksun sağlam dikenler; Ve 3) uzunlamasına dar bir gövdeden ve küresel bir baştan oluşan ince dikenler. Dendritik omurga hacmi, onları kısmen tanımlamak için kullanılır; genellikle küçük ince dikenler (0.01 μm3 </sup>) Mantar omurgalarına kıyasla (0.8 μm 3 ) 9 , 10 . Omurgalar olgunlaşma ile dengelenir. Örneğin, ince dikenler birkaç gün sonra geri çekilir veya mantar omurgalarına dönüşür. Alternatif olarak, mantar dikenleri nispeten kararlıdır ve uzun süre hayatta kalabilir. Nöronal bağlantıların kuvvetinin dikenlerin sayısına ve / veya hacmine 11 , 12 , 13 dayalı olduğu düşünülmektedir.
Klasik Golgi boyama yöntemi ve daha modern varyasyonları, dendritik omurga morfolojisi ve yoğunluğunu incelemek için kullanışlıdır. Golgi boyamasının benzersiz bir özelliği, rasgele toplam nöronların% 5'ini lekelediğidir, bu da bireysel nöronların izini sağlar 14,15. Golgi metasının tam mekanizması olsa daOd lekeleri bireysel nöronlar hala bilinmemektedir, yöntemin prensibi, gümüş kromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17'nin kristalleşmesine dayanmaktadır. Golgi yönteminin üç ana türü vardır: hızlı Golgi, Golgi-Cox ve Golgi-Kopsch 18 , 19 . Her üç yöntem de birkaç gün ila aylarca krom tuzlarında ilk inkübasyon evresi ile başlar ancak aralarında bazı önemli farklar vardır. Hızlı Golgi, ilk aşamada osmiyum tetroksit kullanırken, Golgi-Kopsch paraformaldehid içerir. Hem hızlı Golgi hem de Golgi-Kopsch boyama sonrasında, yaklaşık% 7 oranında,% 1-2 gümüş nitrat solüsyonunda inkübe edilir. Golgi-Cox yöntemi gümüş nitrat yerine mercurik klorür ve potasyum dikromat kullanır ve 2-4 hafta süreyle emprenyasyon süresine sahiptir. Dokular daha sonra kesitlendirilir ve seyreltilmiş amonyakÇözeltiyi, ardından tuzları gidermek için bir fotoğrafik düzeltici uygulayın. Üç tipten Golgi-Cox yönteminin, kısmen arka plana müdahale etmeden dendritik aplikleri boyamakta en iyi olduğu düşünülmektedir, çünkü kısmen kristal yapılar doku yüzeyinde oluşmaz (hızlı Golgi yönteminde olduğu gibi) 17 , 20 , 21 .
Mevcut yöntem, ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün hafif bir varyasyonudur ve nispeten düşük bir dozda 5-Fu'nın dendritik morfolojik özellikleri ve omurganın yoğunluğunu nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır. Elde edilen veriler, kemoterapötik tedavinin nöronal devreleri nasıl etkilediği konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir.
Daha modern tekniklerle karşılaştırıldığında, Golgi-Cox yöntemi, omurga morfolojisini incelemek için tercih edilen yöntem olan çeşitli avantajlara sahiptir: 1) Boyama esasen herhangi bir doku için kullanılabilir 2) Basit bir ışık mikroskopu kurulumu, 3) Golgi-Cox görüntüleme konfokal görüntülemeden daha hızlıdır ve 4) Golgi lekeli bölümler birkaç ay ila yıllarca floresanla işaretlenmiş örneklerden daha uzun süre yaşayabilir. Bu avantajlarla bile, Golgi-Cox yönteminin hala bazı sın?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, NIH P20 GM109005 (ARA) kapsamında bir pilot yardım ve Translational Neuroscience IDeA Programı ödül P30 GM110702 tarafından desteklenmiştir.
superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Permount | Fisher | SP 15-100 | |
Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
Foil | Fisher | 01-213-105 | |
12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
Parafilm | Midsci | HS234526C | |
Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
Neurolucida | mbf Bioscience | ||
Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
Prism | GraphPad |