Rewiring Neuronal Circuits: En Ny Metode til Hurtig Neuritforlængelse og Funktionel Neuronal Forbindelse
Summary
Denne procedure beskriver, hvordan man hurtigt initierer, udvider og forbinder neuritter organiseret i mikrofluidiske kamre ved anvendelse af poly-D-lysin-coatede perler fastgjort til mikropipetter, som styrer neuritforlængelse.
Abstract
Hjerne- og rygmarvsskade kan føre til permanent invaliditet og død, fordi det stadig ikke er muligt at regenerere neuroner over lange afstande og nøjagtigt genoprette dem med et passende mål. Her beskrives en procedure for hurtigt at indlede, forlænge og tilslutte netop nye funktionelle neuronalkredsløb over lange afstande. De opnåede forlængelseshastigheder når over 1,2 mm / time, 30-60 gange hurtigere end in vivo- hastighederne for de hurtigst voksende axoner fra det perifere nervesystem (0,02 til 0,04 mm / t) 28 og 10 gange hurtigere end tidligere rapporteret for det samme Neuronaltype på et tidligere udviklingsstadium 4 . For det første dyrkes isolerede populationer af rottehippocampale neuroner i 2-3 uger i mikrofluidiske indretninger for præcist at positionere cellerne, hvilket muliggør nem mikromomanipulation og eksperimentel reproducerbarhed. Derefter anbringes perler overtrukket med poly-D-lysin (PDL) på neuritter for at danne klæbemiddelkontHandlinger og pipette mikromanipulation anvendes til at bevæge det resulterende perle-neurit-kompleks. Efterhånden som perlen er flyttet, trækker den ud en ny neurit, der kan udvides over hundredvis af mikrometer og funktionelt forbundet til en målcelle på mindre end 1 time. Denne proces muliggør eksperimentel reproducerbarhed og nem manipulation, mens man omgår langsommere kemiske strategier til at fremkalde neurit vækst. Preliminære målinger fremlagt her viser en neuronal vækst, der langt overstiger fysiologiske. Kombination af disse innovationer muliggør den nøjagtige etablering af neuronale netværk i kultur med en hidtil uset grad af kontrol. Det er en roman metode, der åbner døren for en overflod af information og indsigt i signaloverførsel og kommunikation inden for neuronalt netværk samt at være en legeplads for at undersøge grænserne for neuronal vækst. De potentielle anvendelser og eksperimenter er udbredt med direkte konsekvenser for terapier, der sigter mod at genoprette neuronaL kredsløb efter traumer eller i neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Skader på det voksne centralnervesystem (CNS) kan føre til permanent invaliditet på grund af flere mekanismer, der begrænser axonal genvækst 1 . Efter skader danner mange CNS-axoner ikke en ny vækstkegle og undgår at montere et effektivt regenerativ respons 2 . Desuden hæmmer skader og arvæv omkring CNS læsioner signifikant axonal vækst 1 , 2 , 3 . Nuværende terapier til fremme af CNS-regenerering efter skade har fokuseret på at forøge det skadelige neurons intrinsiske vækstpotentiale og på maskering af inhibitorerne af axonal forlængelse forbundet med myelinrester og glialæren 1 , 3 . På trods heraf forbliver kapaciteten til at regenerere lange axoner til fjerne mål og til at danne passende funktionelle synapser fortsat alvorligt begrænset 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
I det nuværende arbejde anvendes mikrobeyler, pipette mikromanipulation og mikrofluidiske indretninger til hurtigt at initiere, forlænge og tilslutte netop nye funktionelle neuronalkredsløb over lange afstande. Tidligere arbejde har vist, at poly-D-lysin-coatede perler (PDL-perler) inducerer membranadhæsion efterfulgt af clustering af synaptiske vesikelkomplekser og dannelse af funktionelle presynaptiske bolte 8 . Det blev også vist, at når PDL-perlen mekanisk trækkes væk efter presynaptisk differentiering, følger den synaptiske proteinklynge perlen, idet en ny neurit 9 initieres. Den følgende fremgangsmåde udnytter denne kendsgerning sammen med evnen til at dyrke embryonale hippocampale neuroner af rotter i organiserede regioner på en dækslip ved anvendelse af polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidiske indretninger til præcist at omdirigere en neuronalkredsløb.
Disse PDMS mikrofluidiske indretninger er ikke-toksiske, optisk transparente og består af to kamre forbundet med et system af mikrokanaler. Når de er monteret på en dæksel, tjener hver enhed som en form til at styre neuronal vækst og opretholde sunde neuronkulturer på præcise mønstre i længere end 4 uger in vitro .
Her præsenteres der en ramme for at undersøge grænserne for udvidelse og funktionalitet af den nye neurit. Nye, funktionelle neuritter skabes og positioneres til styrbart (re) wire neuronale netværk. De opnåede forlængelseshastigheder er hurtigere end 20 μm / min over millimeterskalaafstande, og funktionelle forbindelser etableres. Disse resultater viser uventet, at disse neurites indre kapacitet til forlængelse er meget hurtigere end tidligere antaget. Denne foreslåede mekaniske tilgang omgår langsomme kemiske strategier og muliggør styret forbindelse til et specifikt mål. thEr teknik åbner nye veje til in vitro- undersøgelsen af nye terapier for at genoprette neuronal forbindelse efter skade. Det muliggør også manipulation og omlægning af neuronale netværk til at undersøge grundlæggende aspekter af neuronal signalbehandling og neuronal funktion in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af standard mikromanipulation og innovative mikrofluidiske indretninger blev der udviklet en ny teknik til hurtigt at indlede, forlænge og netop forbinde nye funktionelle neuronalkredsløb over store afstande. Pipette mikromanipulation er et fælles redskab i de fleste neurovidenskab labs 4 , 13 . Den reelle udfordring for at opnå reproducerbare og pålidelige resultater var standardisering af sunde, nøjagtigt positionerede neuronkulturer i eksperi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Yoichi Miyahara for mange nyttige diskussioner og indsigter. MA og PG anerkender finansiering fra NSERC.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
