ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية
Summary
يصف هذا الإجراء كيفية البدء بسرعة، وتوسيع وربط نيوريتس نظمت في غرف ميكروفلويديك باستخدام حبات بولي-D- يسين المغلفة ثابتة إلى ميكروبيبيتس أن دليل استطالة النوريت.
Abstract
إصابات الدماغ والحبل الشوكي قد تؤدي إلى العجز الدائم والموت لأنه لا يزال غير ممكن لتجديد الخلايا العصبية على مسافات طويلة وإعادة توصيلها بدقة مع الهدف المناسب. هنا يتم وصف الإجراء لبدء بسرعة، استطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. معدلات التمدد التي تحققت تصل إلى أكثر من 1.2 ملم / ساعة، 30-60 مرات أسرع من معدلات الجسم الحي من الأسرع محاور الأسرع نموا من الجهاز العصبي المحيطي (0.02 إلى 0.04 ملم / ساعة) 28 و 10 مرات أسرع مما سبق ذكره لنفس نوع الخلايا العصبية في مرحلة مبكرة من التنمية 4 . أولا، تزرع مجموعات معزولة من الخلايا العصبية الحصين الفئران لمدة 2-3 أسابيع في الأجهزة ميكروفلويديك لوضع بدقة الخلايا، مما يتيح سهولة ميكرومانيبولاتيون والتكاثر التجريبية. المقبل، يتم وضع الخرز المغلفة مع بولي- D- يسين (بدل) على نيوريتس لتشكيل لاصق كونتوتستخدم ميكروومانيبولاتيون ماصة لنقل الناتج حبة نيوريت معقدة. كما يتم نقل حبة، فإنه يسحب نيوريت جديدة التي يمكن أن تمتد على مئات من ميكرومتر ومتصل وظيفيا إلى خلية الهدف في أقل من 1 ساعة. هذه العملية تمكن استنساخ التجريبية وسهولة التلاعب في حين تجاوز الاستراتيجيات الكيميائية أبطأ للحث على نمو العصبية. تظهر القياسات الأولية المعروضة هنا معدل نمو الخلايا العصبية تتجاوز بكثير تلك الفسيولوجية. الجمع بين هذه الابتكارات يسمح للإنشاء الدقيق للشبكات العصبية في الثقافة مع درجة غير مسبوقة من السيطرة. بل هو طريقة جديدة تفتح الباب أمام مجموعة كبيرة من المعلومات والأفكار في نقل الإشارات والاتصالات داخل الشبكة العصبية وكذلك كونها ملعبا فيها لاستكشاف حدود نمو الخلايا العصبية. التطبيقات والتجارب المحتملة على نطاق واسع مع آثار مباشرة على العلاجات التي تهدف إلى إعادة ربط نيورونال الدوائر بعد الصدمة أو في الأمراض العصبية التنكسية.
Introduction
الإصابات في الجهاز العصبي المركزي الكبار (نس) قد يؤدي إلى إعاقة دائمة بسبب آليات متعددة تحد من نمو محور عصبي 1 . بعد الإصابة، العديد من المحاور العصبية الجهاز العصبي المركزي لا تشكل مخروط نمو جديد وتفشل في جبل استجابة التجدد فعالة 2 . وعلاوة على ذلك، والضرر والأنسجة ندبة المحيطة الآفات الجهاز العصبي المركزي تمنع بشكل كبير نمو محور عصبي 1 ، 2 ، 3 . وقد ركزت العلاجات الحالية لتعزيز الجهاز العصبي المركزي تجديد بعد الإصابة على تعزيز إمكانات النمو الجوهري للخلايا العصبية المصابة وإخفاء مثبطات تمديد محور عصبي المرتبطة الحطام المايلين والندبة الدبقية 1 ، 3 . على الرغم من هذا، والقدرة على تجديد محاور عصبية طويلة إلى أهداف بعيدة وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المناسبة لا تزال محدودة للغاية 4 ، </sup> 5 ، 6 ، 7 .
في العمل الحالي، وتستخدم ميكروبادس، ميكرومانيبولاتيون ماصة، وأجهزة ميكروفلويديك لبدء بسرعة، واستطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن الخرز بولي-D- يسين المغلفة (بدل الخرز) للحث على التصاق الغشاء تليها تجميع المجمعات الحويصلة متشابك وتشكيل بوتونسابتيك بوريسينابتيك وظيفية 8 . وقد تبين أيضا أنه عندما يتم سحب PDL- حبة ميكانيكيا بعيدا بعد التمايز بريسينابتيك، وتتبع كتلة البروتين متشابك حبة، الشروع في نيوريت جديد 9 . الإجراء التالي يستغل هذه الحقيقة جنبا إلى جنب مع القدرة على ثقافة الخلايا العصبية قرن آمون الجنينية من الفئران في المناطق المنظمة على ساترة باستخدام بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) الأجهزة ميكروفلويديك على وجه التحديد جدد أسلاك العصبيةدائرة كهربائية.
هذه الأجهزة ميكروفلويديك بدمس غير سامة، شفافة بصريا وتتكون من غرفتين متصلة بواسطة نظام ميكروشانلز. مرة واحدة تجميعها على ساترة، كل جهاز بمثابة قالب لتوجيه نمو الخلايا العصبية والحفاظ على الثقافات العصبية صحية على أنماط دقيقة لمدة أطول من 4 أسابيع في المختبر .
هنا، يتم عرض الإطار الذي للتحقيق في حدود التمديد والوظائف من نيوريت جديدة. يتم إنشاء نيوريتس جديدة وظيفية ووضعها على كونترولابيلي (إعادة) شبكات الأسلاك العصبية. معدلات التمديد التي تحققت هي أسرع من 20 ميكرون / دقيقة على مسافات ملليمتر ملليمتر والتوصيلات الوظيفية. هذه النتائج تظهر، بشكل غير متوقع، أن القدرة الذاتية لهذه نيوريتس لاستطالة هو أسرع بكثير مما كان يعتقد سابقا. ويتجاوز هذا النهج الميكانيكي المقترح استراتيجيات كيميائية بطيئة ويتيح الاتصال المراقب لهدف محدد. ثهو تقنية يفتح آفاقا جديدة للدراسة في المختبر من العلاجات الجديدة لاستعادة اتصال الخلايا العصبية بعد الإصابة. كما أنه يتيح التلاعب وإعادة ربط شبكات الخلايا العصبية للتحقيق في الجوانب الأساسية لمعالجة الإشارات العصبية وظيفة الخلايا العصبية في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام ميكرومانيبولاتيون القياسية والأجهزة ميكروفلويديك مبتكرة، تم تطوير تقنية جديدة للبدء بسرعة، استطالة ودقة ربط جديد الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات كبيرة. ميكرومانيبولاتيون ماصة هو أداة مشتركة في معظم مختبرات علم الأعصاب 4 ، <sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر يواشي مياهارا للعديد من المناقشات المفيدة والرؤى. ما و بغ تعترف بتمويل من نسيرك.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
