Rewiring Neuronal Circuits: En ny metod för snabb Neurit förlängning och funktionell Neuronal anslutning
Summary
Denna procedur beskriver hur man snabbt initierar, förlänger och ansluter neuriter organiserade i mikrofluidiska kamrar med användning av poly-D-lysinbelagda pärlor fixerade till mikropipetter som styr neuritöjning.
Abstract
Hjärn- och ryggmärgsskada kan leda till permanent invaliditet och död eftersom det fortfarande inte är möjligt att regenerera neuroner över långa avstånd och noggrant återansluta dem med ett lämpligt mål. Här beskrivs ett förfarande för att snabbt initiera, förlänga och exakt ansluta nya funktionella neuronkretsar över långa avstånd. Förlängningsgraden uppnådde når över 1,2 mm / h, 30-60 gånger snabbare än in vivo- hastigheterna för de snabbast växande axonerna från perifert nervsystem (0,02 till 0,04 mm / h) 28 och 10 gånger snabbare än tidigare rapporterade för samma Neuronaltyp vid ett tidigare utvecklingsstadium 4 . För det första odlas isolerade populationer av råttahippokampala neuroner i 2-3 veckor i mikrofluidiska anordningar för att positionera cellerna exakt, vilket möjliggör enkel mikromanipulation och experimentell reproducerbarhet. Därefter placeras pärlor belagda med poly-D-lysin (PDL) på neuriter för att bilda adhesivHandlingar och pipettmikromomanipulation används för att flytta det resulterande vulst-neuritkomplexet. När pärlan flyttas drar den ut en ny neurit som kan förlängas över hundratals mikrometer och funktionellt kopplad till en målcell på mindre än 1 h. Denna process möjliggör experimentell reproducerbarhet och lätthet av manipulation medan man kringgår långsammare kemiska strategier för att inducera neuritillväxt. Preliminära mätningar presenterade här visar en neuronal tillväxt som är långt överstigande fysiologiska. Kombinationen av dessa innovationer möjliggör en exakt etablering av neuronala nätverk i kultur med en aldrig tidigare skådad grad av kontroll. Det är en ny metod som öppnar dörren till en mängd information och insikter i signalöverföring och kommunikation inom neuronnätet samt att vara en lekplats för att utforska gränserna för neuronal tillväxt. De potentiella tillämpningarna och experimenten är utbredda med direkta konsekvenser för terapier som syftar till att återansluta neuronL-kretsar efter trauma eller i neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Skador på vuxna centrala nervsystemet (CNS) kan leda till permanent invaliditet på grund av flera mekanismer som begränsar axonal återväxt 1 . Efter skada bildar många CNS-axoner inte en ny tillväxtkotte och misslyckas med att montera ett effektivt regenerativ respons 2 . Vidare hämmar skador och ärrvävnader som omger CNS-lesioner signifikant axonal tillväxt 1 , 2 , 3 . Nuvarande terapier för att främja CNS-regenerering efter skada har fokuserat på att öka den skadliga neurons inneboende tillväxtpotential och på att maskera inhibitorerna av axonal förlängning associerad med myelinrusk och glialärret 1 , 3 . Trots detta förblir kapaciteten att regenerera långa axoner till avlägsna mål och att bilda lämpliga funktionella synapser fortfarande allvarligt begränsade 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
I det nuvarande arbetet används mikroblock, pipettmikromanipulering och mikrofluidiska anordningar för att snabbt initiera, förlänga och anslut exakt nya funktionella neuronkretsar över långa avstånd. Tidigare arbete har visat att poly-D-lysin-belagda pärlor (PDL-pärlor) inducerar membranadhesion följt av klustringen av synaptiska vesikelkomplex och bildandet av funktionella presynaptiska bones 8 . Det visades också att när PDL-pärlan mekaniskt dras bort efter presynaptisk differentiering följer den synaptiska proteinklusten pärlan och initierar en ny neurit 9 . Följande procedur utnyttjar detta faktum tillsammans med förmågan att odla embryonala hippocampala neuroner hos råttor i organiserade regioner på en täckglas med användning av polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidiska anordningar för att exakt omdirigera en neuronalkrets.
Dessa PDMS-mikrofluidiska anordningar är icke-toxiska, optiskt transparenta och består av två kamrar anslutna med ett system av mikrokanaler. En gång monterad på en täckglas, fungerar varje enhet som en form för att styra neuronal tillväxt och upprätthålla friska neuronkulturer på exakta mönster längre än 4 veckor in vitro .
Här presenteras en ram för att undersöka gränserna för utvidgning och funktionalitet hos den nya neuriten. Nya, funktionella neuriter skapas och positioneras till styrbart (re) trådnätverk. Förlängningsgraden som uppnåtts är snabbare än 20 μm / min över avstånd från millimeterskala och funktionella anslutningar upprättas. Dessa resultat visar oväntat att den inre kapaciteten hos dessa neuriter för förlängning är mycket snabbare än tidigare trodde. Detta föreslagna mekaniska tillvägagångssätt förbi långsamma kemiska strategier och möjliggör kontrollerad anslutning till ett specifikt mål. thTekniken öppnar nya vägar för in vitro- studien av nya terapier för att återställa neuronal anslutning efter skada. Det möjliggör också manipulation och omkoppling av neuronala nätverk för att undersöka grundläggande aspekter av neuronal signalbehandling och neuronfunktion in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av standard mikromanipulation och innovativa mikrofluidiska anordningar utvecklades en ny teknik för att snabbt initiera, förlänga och exakt ansluta nya funktionella neuronkretsar över stora avstånd. Pipettmikromanipulation är ett vanligt verktyg i de flesta neurovetenskapslaboratorierna 4 , 13 . Den verkliga utmaningen att uppnå reproducerbara och tillförlitliga resultat var standardisering av friska, exakt positionerade neuronkulturer under …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Yoichi Miyahara för många användbara diskussioner och insikter. MA och PG bekräftar finansiering från NSERC.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
