Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo
Summary
Se presenta un protocolo que combina el aislamiento de células y de células enteras patch-clamp de registro para medir las propiedades eléctricas de la primaria células epiteliales disociadas de la cauda de la rata epididimidas. Este protocolo permite investigar las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales primarias para dilucidar adicionalmente el papel fisiológico del epidídimo.
Abstract
El epidídimo es un órgano esencial para la maduración de los espermatozoides y la salud reproductiva. El epitelio epidídimo consiste en tipos de células intrínsecamente conectados que son distintos no sólo en características moleculares y morfológicas sino también en propiedades fisiológicas. Estas diferencias reflejan sus diversas funciones, que en conjunto establecen el microambiente necesario para el desarrollo de espermatozoides post-testicular en el lumen epididimario. La comprensión de las propiedades biofísicas de las células epiteliales epididimales es crítica para revelar sus funciones en el esperma y la salud reproductiva, tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas. Mientras que sus propiedades funcionales aún no se han dilucidado completamente, las células epiteliales epididimales se pueden estudiar mediante la técnica de parche-clamp, una herramienta para medir los eventos celulares y las propiedades de membrana de células individuales. Aquí, describimos los métodos de aislamiento de células y de células enteras de pinza de sujeción de grabación a meaAsegúrese de las propiedades eléctricas de las células epiteliales disociadas primarias de la rata cauda epididimidos.
Introduction
El epidídimo en el tracto reproductor masculino es un órgano revestido con una capa de células epiteliales de mosaico. Al igual que en otros tejidos epiteliales, los diversos tipos celulares del epitelio epidídimo, incluyendo células principales, células claras, células basales y células de los sistemas inmunológico y linfático, trabajan de manera concertada para funcionar como la barrera en el frente del túbulo y como Células de apoyo para la maduración de los espermatozoides y la fisiología 1 , 2 , 3 . Por lo tanto, estas células epiteliales desempeñan un papel esencial en la salud reproductiva.
Las células epiteliales se consideran generalmente como células no excitables que son incapaces de generar potenciales de acción de todo o nada en respuesta a los estímulos despolarizantes, debido a la falta de canales de Na + o Ca 2 + con voltaje controlado 4 , 5 . Sin embargo, las células epiteliales expresan uniQue conjuntos de canales de iones y los transportadores que regulan sus funciones fisiológicas especializadas, como la secreción y el transporte de nutrientes [ 6] . Diferentes células epiteliales, por lo tanto, poseen características eléctricas características. Por ejemplo, las células principales expresan el CFTR para el transporte de fluidos y cloruros y expresan el TRPV6 para la reabsorción de calcio, mientras que las células claras expresan la bomba de protones V-ATPasa para la acidificación luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Algunos transportadores y canales iónicos que regulan las características fisiológicas de las células epiteliales epididimales han sido reportados, pero las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales en gran parte aún no se conocen 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-cell patch-clamp es una técnica bien establecida para examinar las propiedades intrínsecas de ambas células excitables y no excitables, y es particularmente útil para estudiar las funciones de células primariamente disociadas en muestras de células heterogéneas; La pinza de tensión se utiliza para medir las propiedades de la membrana pasiva y las corrientes iónicas de las células individuales 14 , 15 . Las propiedades de la membrana pasiva incluyen resistencia de entrada y capacitancia. El primer parámetro indica la conductancia intrínseca de la membrana, mientras que el segundo implica el área superficial de la membrana celular (una bicapa de fosfolípidos, donde están localizados los canales iónicos y los transportadores, que sirve como aislante fino que separa los medios extracelulares e intracelulares). La capacitancia de la membrana es directamente proporcional a la superficie de la membrana celular. Junto con la resistencia de la membrana que se refleja por la resistencia de entrada, la constante de tiempo de la membrana, wQue indica la rapidez con que el potencial de la membrana celular responde al flujo de las corrientes de los canales iónicos. A este respecto, al combinar las características de respuesta de corriente de una serie de etapas de tensión aplicadas a las células, se determinan las cinéticas biofísicas y las propiedades de las células 15 , 16 , 17 , 18 .
En el presente artículo se describen los procedimientos para aislar células epiteliales del epidídimo de cauda de rata y los pasos para medir las propiedades de membrana de diferentes tipos de células en la mezcla de células disociadas usando la abrazadera de parche de células enteras. Se muestra que las células epididimales principales exhiben propiedades electrofisiológicas de membrana distintas y que las conductancias pueden identificarse fácilmente a partir de otros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, la dispersión enzimática de los epididimidos de cauda de rata produjo consistentemente células epiteliales sanas. La calidad de las células epiteliales epididimales para los experimentos de parche-clamp depende de unos pocos pasos críticos en el protocolo. Por ejemplo, la centrifugación de la mezcla celular a una fuerza centrífuga baja (30 xg) es importante para eliminar los espermatozoides y el contenido luminal epidídimo; Las células epiteliales del epidídimo se vuelven insalubres en prese…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias al Dr. Christopher Antos por sus útiles comentarios sobre el texto. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento inicial de la Universidad de ShanghaiTech otorgado a Winnie Shum y por el financiamiento de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NNSFC N ° 31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
