تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف
Summary
ويعتمد تطوير المجتمعات الميكروبية على مجموعة من العوامل، بما في ذلك العمارة البيئية، وفرة الأعضاء، والصفات، والتفاعلات. يصف هذا البروتوكول بيئة الاصطناعية، ميكروفابريكاتد لتتبع في وقت واحد من الآلاف من المجتمعات الواردة في آبار فيمتوليتر، حيث يمكن تقريب العوامل الرئيسية مثل حجم المتخصصة والحبس.
Abstract
ويعتمد تطور المجتمعات الميكروبية على مجموعة من العوامل الحتمية والعوامل العشوائية المعقدة التي يمكن أن تغير بشكل كبير التوزيع المكاني وأنشطة أفراد المجتمع المحلي. قمنا بتطوير منصة مجموعة ميكرويل التي يمكن استخدامها لتجميع بسرعة وتتبع الآلاف من المجتمعات البكتيرية في موازاة ذلك. هذا البروتوكول يسلط الضوء على فائدة المنصة ويصف استخدامه لرصد بصريا لتطوير المجتمعات بسيطة، مكونة من عضوين ضمن مجموعة من المصفوفات داخل المنصة. يستخدم هذا المظاهرة اثنين من المسوخ من الزائفة الزنجارية ، وهي جزء من سلسلة من المسوخ المتقدمة لدراسة النوع السادس إفراز المرضية. إدراج الكروموسومات إما من مشيري أو الجينات غفب تسهيل التعبير التأسيسي من البروتينات الفلورية مع أطوال موجية الانبعاثات التي يمكن استخدامها لرصد وفرة عضو المجتمع والموقع داخل كل ميكرويل. يصف هذا البروتوكول ميثو مفصلد لتجميع مخاليط من البكتيريا في آبار الصفيف واستخدام التصوير الزمني مضان الفاصل الزمني وتحليل الصور الكمية لقياس النمو النسبي لكل فرد من السكان على مر الزمن. البذر والتجمع من منصة ميكرويل، وإجراءات التصوير اللازمة للتحليل الكمي للمجتمعات الميكروبية داخل مجموعة، والأساليب التي يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين منطقة الأنواع الميكروبية جميع نوقشت.
Introduction
تتشكل المجتمعات الميكروبية من قبل العوامل الحتمية، مثل بنية البيئة، والعمليات العشوائية، التي ترتبط مع موت الخلايا، والانقسام، وتركيز البروتين، وعدد من العضيات، والطفرات 1 . وفي البيئة الطبيعية، قد يكون من المستحيل تقريبا تحليل التأثير الفردي لهذه التأثيرات على تكوين المجتمع ونشاطه. إن تحديد أفراد المجتمع المحلي ومواصلة حل توزيعهم المكاني الزماني في البيئة الطبيعية أمر محفوف بالمخاطر بسبب وجود هياكل طبيعية ودفنها داخل بيئة كيميائية وبيولوجية. ومع ذلك، فقد أكدت الجهود المبذولة مؤخرا أهمية التنظيم المكاني على وظيفة المجتمع المحلي، وتشير إلى ضرورة مراعاة وفرة الأعضاء وتنظيمهم في الدراسات الجارية 2 و 3 و 4 .
هذامن الواضح أن البيئة الكيميائية المحلية ( أي توافر المغذيات والمستقلبات الثانوية)، والبنية المادية ( مثل بنية التربة، وجذور النباتات، وجسيمات المحيطات، أو الميكروفيلي المعوي)، ووجود أو غياب الأكسجين، وإدخال جميع الأنواع المسببة للأمراض تؤثر على تكوين، والهندسة المعمارية، ووظيفة المجتمعات الميكروبية 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . ومع ذلك، فإن التقنيات التقليدية للثقافات التي تهمل الاستيلاء على هذه العوامل لا تزال سائدة. تكوين المجتمع (على سبيل المثال، وجود الأنواع التي تعتمد على مشترك)، والتعلق الجسدي، وتركيز جزيء الإشارات، والاتصال المباشر خلية الخلية كلها عوامل هامة لتشكيل المجتمع الميكروبي ويمكن أن تضيع في جظروف الثقافة التقليدية. هذه الخصائص يصعب تكرارها في ثقافة السائلة السائبة أو على لوحة أجار. ومع ذلك، فإن توافر تقنيات ميكروفلويديك، ميكروباترنينغ، و نانوفابريكاتيون التي تسمح بتكرار الميزات الفيزيائية والكيميائية الرئيسية للبيئات الطبيعية، مكنت العديد من الباحثين من بناء مجتمعات بكتيرية لدراسة تفاعلاتهم 12 و 13 و 14 وتطوير البيئات التركيبية التي تحاكي الظروف الطبيعية 4 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19 ، 20 .
يصف هذا البروتوكول طريقة لافتعال جهاز مجموعة ميكرويل ويوفر إجراءات تجريبية مفصلة التي يمكن استخدامها ل فونكتيوناليز ثوآبار في الصفيف، وتنمو البكتيريا، سواء كمستعمرات من نوع واحد أو في مجتمعات متعددة الأعضاء. ويوضح هذا العمل أيضا كيفية تعديل البكتيريا لإنتاج البروتينات الفلورسنت مراسل يمكن استخدامها لرصد النمو البكتيري داخل الآبار مع مرور الوقت. تم عرض مجموعة مماثلة سابقا وأظهرت أنه من الممكن تتبع نمو مستعمرات من نوع واحد من الزائفة الزنجارية ( P. الزنجارية) في ميكرويلز. من خلال تعديل حجم جيدا وكثافة البذر، وظروف انطلاق الآلاف من التجارب النمو يمكن أن تتنوع في موازاة لتحديد كيفية تأثير شروط التطعيم الأولية على قدرة البكتيريا في النمو 21 . يستخدم العمل الحالي نسخة معدلة قليلا من مجموعة ميكرويل التي تبني على العمل السابق من خلال تمكين المقارنة في وقت واحد من المصفوفات متعددة وباستخدام بروتوكول تجريبي أكثر قوة. المصفوفة المستخدمة في هذا العمل تحتوي على عدة سوباريز، أو صفيف إنسمبئر، تحتوي على آبار ذات أحجام مختلفة، تتراوح بين 15 – 100 ميكرون في القطر، والتي يتم ترتيبها في ثلاثة الملعب مختلفة ( أي 2X، 3X، و 4X قطر جيدا). يتم حفر الصفائف في السيليكون، ويتم تمكين نمو البكتيريا المصنفة في صفائف السيليكون عن طريق ختم الصفائف مع ساترة التي تم طلاءها مع هلام الاغاروز متوسطة الغرس. P. الطائر الزنجارية مصممة لدراسة نوع إفراز نظام تستخدم في هذه المظاهرة.
النتائج المعروضة هنا بناء نحو الهدف النهائي من تحليل المجتمعات مولتيمبر داخل صفائف ميكرويل، مما يتيح للباحثين لرصد وفرة وتنظيم البكتيريا في الموقع في حين السيطرة والتحقق من البيئة الكيميائية. وينبغي أن يوفر ذلك في نهاية المطاف نظرة ثاقبة عن "القواعد" التي تحكم تنمية المجتمع والخلافة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدمت هذه المادة جهاز صفيف ميكرويل والبروتوكولات التجريبية المصممة لتمكين الإنتاجية العالية والمحتوى عالي الخلية القائمة على التصوير التصوير القائم على تحليل التنمية المجتمعية البكتيرية. في حين أن تركيز المظاهرة هنا كان لدراسة آثار إفراز النوع السادس بوساطة الاتص…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تصنيع صفائف ميكرويل وتتميز في مركز علوم المواد النانوية قسم المرافق المستخدم، مكتب علوم الطاقة الأساسية، وزارة الطاقة الأمريكية. وقدم الدعم المالي لهذا العمل من خلال صندوق البحوث والتنمية التابع لمدير مختبر أوك ريدج الوطني. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا مختبر J. مغوس (جامعة واشنطن، سياتل، وا) لتوريد سلالات P. أيروجينوسا المستخدمة في هذه الدراسات.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
