Samling og sporing af mikrobiell fællesskabsudvikling inden for en Microwell Array Platform
Summary
Udviklingen af mikrobielle samfund afhænger af en kombination af faktorer, herunder miljøarkitektur, medlemskrænkelse, træk og interaktioner. Denne protokol beskriver et syntetisk, mikrofabrikeret miljø til samtidig tracking af tusinder af samfund indeholdt i femtoliter brønde, hvor nøglefaktorer såsom niche størrelse og indeslutning kan tilnærmes.
Abstract
Udviklingen af mikrobielle samfund afhænger af en kombination af komplekse deterministiske og stokastiske faktorer, som dramatisk kan ændre rummets fordeling og aktiviteter i fællesskabsmedlemmer. Vi har udviklet en mikrowell array platform, som kan bruges til hurtigt at samle og spore tusindvis af bakterielle samfund parallelt. Denne protokol fremhæver platformens anvendelighed og beskriver dens anvendelse til optisk overvågning af udviklingen af simple, tomedlemsamfund inden for et ensemble af arrays inden for platformen. Denne demonstration anvender to mutanter af Pseudomonas aeruginosa , en del af en række mutanter udviklet til at studere patogenitet af type VI-sekretion. Kromosomale indlæg af enten mCherry- eller GFP-gener letter den konstitutive ekspression af fluorescerende proteiner med forskellige emissionsbølgelængder, som kan bruges til at overvåge overlegenhed og lokalitet inden for hver mikrobølge. Denne protokol beskriver en detaljeret methoD til montering af blandinger af bakterier i brøndene i arrayet og anvendelse af tidsforskydningsfluorescensbilleddannelse og kvantitativ billedanalyse til måling af den relative vækst for hver medlemspopulation over tid. Sejningen og samlingen af microwell-platformen, de billeddannelsesprocedurer, der er nødvendige for den kvantitative analyse af mikrobielle samfund i gruppen, og de metoder, der kan anvendes til at afsløre interaktioner mellem mikrobielle arter, som alle diskuteres.
Introduction
Mikrobielle samfund er formet af både deterministiske faktorer, såsom miljøets struktur og stokastiske processer, som er forbundet med celledød, opdeling, proteinkoncentration, antal organeller og mutation 1 . Inden for det naturlige miljø kan det næsten umuligt at analysere de individuelle virkninger af disse påvirkninger på samfunds sammensætning og aktivitet. Obscured af naturlige strukturer og begravet inden for et kemisk og biologisk miljø, er det ekstremt udfordrende at identificere samfundets medlemmer og yderligere løse deres spatiotemporale fordeling inden for det naturlige miljø. Ikke desto mindre har de seneste bestræbelser understreget betydningen af rumlig organisation på samfundsfunktionen og peger på behovet for at redegøre for både medlemskvalitet og organisation i løbende studier 2 , 3 , 4 .
DetDet er tydeligt, at det lokale kemiske miljø ( dvs. tilgængeligheden af næringsstoffer og sekundære metabolitter), den fysiske struktur ( f.eks. Jordarkitektur, planterødder, havpartikler eller tarmmilvilli), tilstedeværelse eller fravær af ilt og indførelsen af Patogene arter har alle indflydelse på mikrobielle samfunds sammensætning, arkitektur og funktion 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Ikke desto mindre fortsætter traditionelle teknikker til kulturer, der forsømmer at opfange disse faktorer, at sejre. Fælles sammensætning ( fx tilstedeværelsen af co-afhængige arter), fysisk binding, signalmolekylkoncentration og direkte cellecellekontakt er alle vigtige faktorer for at forme et mikrobielt samfund og kan gå tabt i cUventede kulturbetingelser. Disse egenskaber er vanskelige at replikere i en bulkvæskekultur eller på en agarplade. Tilgængeligheden af mikrofluidiske, mikropatterings- og nanofabrikationsteknikker, der muliggør replikation af nøgle fysiske og kemiske egenskaber i naturlige miljøer har dog gjort det muligt for mange forskere at opbygge bakteriefællesskaber for at studere deres interaktioner 12 , 13 , 14 og at udvikle syntetiske miljøer, der Efterligne naturlige forhold 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af en microwell array enhed og giver detaljerede eksperimentelle procedurer, som kan bruges til at funktionalisere thE brønde i rækken og at vokse bakterier, både som single-species kolonier og i multi-medlems samfund. Dette arbejde viser også, hvordan bakterier, der er modificeret til fremstilling af fluorescerende reporterproteiner, kan anvendes til at overvåge bakterievækst i brønde over tid. En lignende matrix blev præsenteret tidligere og viste, at det er muligt at spore væksten af enkeltartskolonier af Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) i mikrobrønde. Ved at modulere brøndstørrelse og seedensitet kan startbetingelserne for tusindvis af vækstforsøg varieres parallelt for at bestemme, hvordan de indledende inokulationsbetingelser påvirker bakteriens evne til at vokse 21 . Det nuværende arbejde bruger en lidt ændret version af microwell-arrayet, der bygger på det foregående arbejde, ved at muliggøre samtidig sammenligning af flere arrayer og ved hjælp af en mere robust forsøgsprotokol. Arrayet, der bruges i dette arbejde, indeholder flere undergrupper eller array ensemBles, der indeholder brønde i forskellige størrelser, varierende fra 15 til 100 μm i diameter, der er arrangeret på tre forskellige pladser ( dvs. 2x, 3x og 4x brønddiameteren). Arraysne er ætset i silicium, og væksten af bakterierne, der er podet i silicium-arrays, aktiveres ved at forsegle arraysne med en dæksel, der er belagt med en medium-infusions agarosegel. P. aeruginosa mutanter designet til at studere type VI sekretionssystemet anvendes i denne demonstration.
Resultaterne præsenteret her bygger op til det ultimative mål at analysere multimember-samfund inden for microwell arrays, hvilket gør det muligt for forskere at overvåge overflod og organisering af bakterier in situ, samtidig med at man kontrollerer og proberer det kemiske miljø. Dette skal i sidste ende give indsigt i "reglerne", der styrer samfundsudvikling og arv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel præsenterede en microwell array-enhed og eksperimentelle protokoller designet til at muliggøre høj-gennemgang og højindhold levende celle billedbaseret analyse af bakteriel samfund udvikling. Mens demonstrationens fokus her var at studere virkningerne af kontaktmidlet type VI-sekretion på fællesskabsudvikling, var arraysne designet til at være fleksible og rumme undersøgelsen af en bred vifte af mikrobielle samfund og mikrobe-mikrobe interaktioner. Arbejdet her fokuserer udelukkende på bruge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microwell-arrays blev fremstillet og karakteriseret ved Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Finansiel støtte til dette arbejde blev ydet gennem Oak Ridge National Laboratory Director's Research and Development Fund. Forfatterne vil også gerne takke J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) for levering af P. aeruginosa stammer anvendt i disse undersøgelser .
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
