Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform
Summary
De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van factoren, waaronder milieu-architectuur, lidmaatschap, eigenschappen en interacties. Dit protocol beschrijft een synthetische microfabriek die gelijktijdig wordt bijgehouden van duizenden gemeenschappen in femtoliterputten, waar sleutelfactoren zoals nisgrootte en bevalling kunnen worden benaderd.
Abstract
De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van complexe deterministische en stochastische factoren die de ruimtelijke verdeling en de activiteiten van gemeenschapsleden dramatisch kunnen veranderen. We hebben een microwell array platform ontwikkeld dat kan worden gebruikt om tegelijkertijd duizenden bacteriële gemeenschappen snel te monteren en te volgen. Dit protocol benadrukt het nut van het platform en beschrijft het gebruik ervan voor het optisch bewaken van de ontwikkeling van eenvoudige, twee-leden gemeenschappen binnen een ensemble arrays binnen het platform. Deze demonstratie maakt gebruik van twee mutanten Pseudomonas aeruginosa , onderdeel van een reeks mutanten die ontwikkeld zijn om de pathogeniciteit van type VI af te studeren. Chromosomale inserts van either mCherry of GFP genen vergemakkelijken de constitutieve expressie van fluorescerende proteïnen met verschillende emissie golflengten die kunnen worden gebruikt om gemeenschapslid overvloed en plaats binnen elke microwell te controleren. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methoD voor het monteren van mengsels van bacteriën in de putten van de matrix en gebruikmaking van time-lapse fluorescentie beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse om de relatieve groei van elke ledenpopulatie mettertijd te meten. Het zaaien en monteren van het microwell platform, de beeldprocedures die nodig zijn voor de kwantitatieve analyse van microbiële gemeenschappen binnen de matrix, en de methoden die kunnen worden gebruikt om interacties tussen microbiële soorten te ontdekken die allemaal besproken zijn.
Introduction
Microbiële gemeenschappen worden gevormd door zowel deterministische factoren, zoals de structuur van het milieu, en stochastische processen, die samenhangen met celdood, verdeling, eiwitconcentratie, aantal organellen en mutatie 1 . Binnen de natuurlijke omgeving kan het bijna onmogelijk zijn om de individuele impact van deze invloeden te analyseren op de samenstelling van de gemeenschap en de activiteit. Verduisterd door natuurlijke structuren en begraven in een chemisch en biologisch milieu, is het uitermate uitdagend om de leden van de gemeenschap te identificeren en hun spatiotemporale verdeling verder te oplossen in het natuurlijke milieu. Niettemin hebben recente inspanningen het belang van ruimtelijke organisatie over de gemeenschapsfunctie onderstreept en gewezen op de noodzaak om in beide lopende studies 2 , 3 , 4 rekening te houden met zowel de overvloed van de leden als de organisatie.
HetHet is duidelijk dat de lokale chemische omgeving ( dat wil zeggen de beschikbaarheid van voedingsstoffen en secundaire metabolieten), de fysieke structuur ( bijv. Grondarchitectuur, plantaardige wortels, oceaandeeltjes of darmmicrovilli), aanwezigheid of afwezigheid van zuurstof en de introductie van Pathogene soorten hebben allemaal invloed op de samenstelling, de architectuur en de functie van microbiële gemeenschappen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Niettemin blijven traditionele technieken voor culturen die deze factoren nalaten te vangen, nog steeds overwinnen. Gemeenschapssamenstelling ( bijv. De aanwezigheid van medeafhankelijke soorten), fysieke binding, signaalmolecuulconcentratie en directe cel-celcontact zijn alle belangrijke factoren voor het vormen van een microbiële gemeenschap en kunnen verloren gaan in cOnvruchtbare cultuuromstandigheden. Deze eigenschappen zijn moeilijk te repliceren in een bulk vloeibare cultuur of op een agarplaat. De beschikbaarheid van microfluïdische, micropattering en nanofabricatie technieken die de replicatie van belangrijke fysieke en chemische eigenschappen van natuurlijke omgevingen mogelijk maken, heeft echter veel onderzoekers mogelijk gemaakt om bacteriële gemeenschappen te bouwen om hun interacties 12 , 13 , 14 te bestuderen en om synthetische omgevingen te ontwikkelen die Naboots natuurlijke omstandigheden 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Dit protocol beschrijft een methode om een microwell array-apparaat te fabriceren en gedetailleerde experimentele procedures die kunnen worden gebruikt om de functie te functionaliserenE putten in de matrix en bacteriën groeien, zowel als enkel-species kolonies en in multi-lid gemeenschappen. Dit werk laat ook zien hoe bacteriën die zijn gemodificeerd om fluorescerende reporter eiwitten te produceren, gebruikt kunnen worden om de bacteriële groei binnen de putjes te monitoren over de tijd. Een soortgelijke matrix werd eerder gepresenteerd en toonde aan dat het mogelijk is om de groei van enkel-species kolonies van Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) in microwellen te volgen. Door de grootte van de put en de zadedichtheid te moduleren, kunnen de startomstandigheden van duizenden groeivergronden parallel worden gevarieerd om te bepalen hoe de initiële inoculatieomstandigheden het vermogen van de bacteriën om te groeien beïnvloeden 21 . Het huidige werk maakt gebruik van een licht gewijzigde versie van de microwell array die op het vorige werk bouwt door de simultane vergelijking van meerdere arrays mogelijk te maken en door een robuuster experimenteel protocol te gebruiken. De array die in dit werk wordt gebruikt bevat meerdere subarrays, of array ensemBles, die wells van verschillende afmetingen bevatten, variërend van 15 tot 100 μm in diameter, die op drie verschillende plaatsen ( dwz 2x, 3x en 4x de brede diameter) zijn aangebracht. De arrays worden geëtst in silicium en de groei van de bacteriën die in de siliconenrails worden gezaaid, wordt geactiveerd door de arrays te verzegelen met een deklaag die is bekleed met een middellangige agarosegel. P. aeruginosa mutanten die ontworpen zijn om het type VI secretiesysteem te bestuderen worden in deze demonstratie gebruikt.
De hier gepresenteerde resultaten bouwen naar het uiteindelijke doel van het analyseren van multimember gemeenschappen binnen microwell arrays, waardoor onderzoekers de overvloed en de organisatie van bacteriën in situ kunnen controleren, terwijl de chemische omgeving wordt gecontroleerd en gecontroleerd. Dit zou uiteindelijk inzichten moeten geven in de "regels" die de ontwikkeling en opvolging van de gemeenschap regelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel werd een microwell array-apparaat en experimentele protocollen gepresenteerd die een hoge-doorvoer en een hoogwaardige analyse op basis van live-cellen op basis van de analyse van de bacteriële gemeenschap mogelijk maken. Terwijl de focus van de demonstratie hier was om de effecten van contactgemedieerde type VI-secretie op gemeenschapsontwikkeling te bestuderen, werden de arrays ontworpen om flexibel te zijn en tegemoet te komen aan de studie van een breed scala aan microbiële gemeenschappen en microbe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microwell arrays werden vervaardigd en gekenmerkt door de afdeling Centrum voor Nanofase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Financiële steun voor dit werk is verstrekt door het Research and Development Fund van de Oak Ridge National Laboratory Director. De auteurs willen ook het J. Mougous Laboratorium (University of Washington, Seattle, WA) bedanken voor de levering van P. aeruginosa stammen die in deze studies werden gebruikt.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
