העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell
Summary
הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים, כולל אדריכלות סביבתית, שפע חבר, תכונות, ואינטראקציות. פרוטוקול זה מתאר סביבה סינתטי, microfabricated למעקב בו זמנית של אלפי קהילות הכלול בארות femtoliter, שבו גורמים מרכזיים כגון גודל נישה כליאה ניתן בקירוב.
Abstract
הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים דטרמיניסטיים וסטוכסטיים מורכבים שיכולים לשנות באופן דרמטי את ההתפלגות המרחבית ואת פעילותם של חברי הקהילה. פיתחנו פלטפורמת מערך microell שניתן להשתמש בה במהירות להרכיב ולעקוב אחר אלפי קהילות חיידקים במקביל. פרוטוקול זה מדגיש את השירות של הפלטפורמה ומתאר את השימוש שלה עבור ניטור אופטי של פיתוח של קהילות פשוטות, שתי חברות בתוך אנסמבל של מערכים בתוך הפלטפורמה. הדגמה זו משתמשת בשני מוטציות של Pseudomonas aeruginosa , חלק מסדרה של מוטציות שפותחו כדי לחקור פתוגניות של סוג VI. הוספת כרומוזומלית של גנים mCherry או GFP או להקל על הביטוי המכונן של חלבונים ניאון עם אורכי גל פליטה שונים שניתן להשתמש בהם כדי לפקח על שפע הקהילה ואת המיקום בתוך microwell. פרוטוקול זה מתאר מת 'מפורטד להרכבת תערובות של חיידקים לתוך הבארות של המערך ושימוש זמן לשגות הדמיה פלואורסציה ניתוח כמותי התמונה כדי למדוד את הצמיחה היחסית של כל אוכלוסייה חבר לאורך זמן. זריעה והרכבה של פלטפורמת microwell, ההליכים הדמיה הכרחי לניתוח כמותי של קהילות חיידקים בתוך המערך, ואת השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לחשוף אינטראקציות בין מינים באזור מינים כל דנו.
Introduction
קהילות מיקרוביאליות מעוצבות על ידי גורמים דטרמיניסטיים, כגון מבנה הסביבה ותהליכים סטוכסטיים, הקשורים למוות תאים, חלוקה, ריכוז חלבון, מספר האברונים, ומוטציה 1 . בתוך הסביבה הטבעית, זה כמעט בלתי אפשרי לנתח את ההשפעה הפרטנית של השפעות אלה על הרכב הקהילה ופעילותה. המסתתרים על ידי מבנים טבעיים ונקברים בתוך סביבה כימית וביולוגית, זיהוי חברי הקהילה והמשך פתרון הפיצול הספטיוטמפוראלי שלהם בתוך הסביבה הטבעית הם מאתגרים ביותר. עם זאת, המאמצים האחרונים הדגישו את חשיבותו של הארגון המרחבי על תפקוד הקהילה והצביעו על הצורך לתת דין וחשבון על שפע הארגון וארגונו במחקרים מתמשכים 2 , 3 , 4 .
זהברור כי הסביבה הכימית המקומית ( כלומר , הזמינות של חומרים מזינים וחילוף חומרים משני), המבנה הפיזי ( למשל, ארכיטקטורה של אדמה, שורשי צמחים, חלקיקי האוקיינוס או מיקרוביילי המעי), נוכחות או היעדר חמצן והכנסת מינים פתוגניים משפיעים על הרכב, ארכיטקטורה ותפקוד של קהילות מיקרוביאליות 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . עם זאת, טכניקות מסורתיות עבור תרבויות הזנחה ללכוד גורמים אלה ממשיכים לגבור. הרכב הקהילה ( למשל, נוכחות של מינים תלויי תלות), התקשרות פיזית, ריכוז מולקולה איתות, קשר ישיר תא סלולרי הם כל הגורמים החשובים לעיצוב קהילה חיידקים והוא יכול ללכת לאיבוד גתנאי התרבות האונבנציונלית. מאפיינים אלה קשה לשכפל בתרבות נוזלי בתפזורת או על צלחת אגר. הזמינות של טכניקות microfluidic, micropatterning ו- nanofabrication המאפשרות שכפול של תכונות פיסיקליות וכימיות עיקריות של סביבות טבעיות אפשרה לחוקרים רבים לבנות קהילות חיידקים כדי לחקור את האינטראקציות שלהם 12 , 13 , 14 ולפתח סביבות מלאכותיות לחקות את התנאים הטבעיים 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק מכשיר מערך microell ומספק נהלים ניסיוניים מפורט שניתן להשתמש בהם כדי פונקציונליE wells במערך לגדל חיידקים, הן כמושבות יחיד מינים בקהילות מרובות חברים. עבודה זו גם ממחישה כיצד חיידקים שונה כדי לייצר חלבונים הכתב ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על צמיחה חיידקים בתוך בארות לאורך זמן. מערך דומה הוצג בעבר הראה כי ניתן לעקוב אחר הצמיחה של מינים בודדים מינים של Pseudomonas aeruginosa ( פ aeruginosa) ב microwells. על ידי שינוי גודל וצפיפות זריעה היטב, התנאים ההתחלתיים של אלפי ניסויים הצמיחה יכול להיות מגוונות במקביל כדי לקבוע כיצד תנאי חיסון ראשוני להשפיע על היכולת של חיידקים לגדול 21 . העבודה הנוכחית משתמשת בגירסה שונה מעט של מערך microwell אשר בונה על העבודה הקודמת בכך שהוא מאפשר השוואה בו זמנית של מערכים מרובים באמצעות פרוטוקול ניסיוני חזק יותר. המערך שבו נעשה שימוש בעבודה זו מכיל מספר תת-מערכות משנה, או מערך אנסםBles, המכיל בארות בגדלים שונים, הנעים בין 15-100 מיקרומטר בקוטר, אשר מסודרים על שלוש זפות שונות ( כלומר 2x, 3x, ו 4x קוטר). מערכים הם חרוט לתוך סיליקון, ואת הצמיחה של חיידקים seeded במערכי הסיליקון מאופשר על ידי איטום מערכים עם coverslip כי כבר מצופה עם ג'ל agarose בינונית חדורים. P. aeruginosa מוטנטים שנועדו ללמוד את מערכת הפרשת סוג VI משמשים בהפגנה זו.
התוצאות המוצגות כאן לבנות לקראת המטרה האולטימטיבית של ניתוח קהילות multimember בתוך מערכים microwell, המאפשר לחוקרים לפקח על שפע וארגון של חיידקים באתרם תוך שליטה וחוקר הסביבה הכימית. זה צריך בסופו של דבר לספק תובנות את "הכללים" אשר קובעים פיתוח הקהילה ואת הירושה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה הציג מכשיר מערך microell ופרוטוקולים ניסיוניים שנועדו לאפשר תפוקה גבוהה תוכן גבוהה לחיות תא הדמיה מבוסס ניתוח של פיתוח הקהילה חיידקים. בעוד שמיקוד ההפגנה כאן היה לבחון את ההשפעות של הפרשת סוג 6 על פיתוח הקהילה, המערכים נועדו להיות גמישים ולהתאים את המחקר למגוון ר…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מערכים Microwell היו מפוברקות מאופיין במרכז חומרים Nanophase מדעי משתמש מתקני החטיבה, משרד בסיסי מדעי האנרגיה, מחלקת האנרגיה של ארה"ב. תמיכה כספית לעבודה זו נמסרה באמצעות Oak Ridge National Laboratory מנהל מחקר ופיתוח הקרן. המחברים גם רוצים להודות למעבדה ג 'יי מוגז (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, WA) על אספקת זנים פ aeruginosa המשמשים מחקרים אלה.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
