Montering og sporing av mikrobiel samfunnsutvikling innenfor en Microwell Array-plattform
Summary
Utviklingen av mikrobielle samfunn avhenger av en kombinasjon av faktorer, inkludert miljøarkitektur, medlemmelig overflod, egenskaper og interaksjoner. Denne protokollen beskriver et syntetisk, mikrofabrikerte miljø for samtidig sporing av tusenvis av lokalsamfunn som finnes i femtoliter brønner, hvor nøkkelfaktorer som nisjestørrelse og inneslutning kan tilnærmet.
Abstract
Utviklingen av mikrobielle samfunn avhenger av en kombinasjon av komplekse deterministiske og stokastiske faktorer som kan dramatisk forandre den geografiske fordeling og aktiviteter av fellesskapsmedlemmer. Vi har utviklet en mikrowell array plattform som kan brukes til å raskt samle og spore tusenvis av bakterielle samfunn i parallell. Denne protokollen fremhever bruken av plattformen og beskriver bruken av den for optisk overvåking av utviklingen av enkle, tomedlemsamfunn innenfor et ensemble av arrays innenfor plattformen. Denne demonstrasjonen bruker to mutanter av Pseudomonas aeruginosa , en del av en rekke mutanter utviklet for å studere patogenitet av type VI-sekresjon. Kromosomale innlegg av enten mCherry- eller GFP-gener letter den konstitutive ekspresjonen av fluorescerende proteiner med forskjellige utslippsbølgelengder som kan brukes til å overvåke fellesskapets overflod og plassering i hver mikrowell. Denne protokollen beskriver en detaljert metoD for å samle blandinger av bakterier inn i brønnene i matrisen og ved bruk av tid-lapse-fluorescensbilder og kvantitativ bildeanalyse for å måle den relative veksten av hver medlemsbefolkning over tid. Såing og montering av mikrowellplattformen, bildebehandlingsprosedyrene som er nødvendige for den kvantitative analysen av mikrobielle samfunn i gruppen, og metodene som kan brukes til å avdekke interaksjoner mellom mikrobielle arter som diskuteres.
Introduction
Mikrobielle samfunn er formet av både deterministiske faktorer, som miljøstruktur og stokastiske prosesser, som er forbundet med celledød, divisjon, proteinkonsentrasjon, antall organeller og mutasjon 1 . Innenfor det naturlige miljøet kan det være nesten umulig å analysere den individuelle effekten av disse påvirkningene på samfunnssammensetning og aktivitet. Obscured av naturlige strukturer og begravet i et kjemisk og biologisk miljø, er det svært utfordrende å identifisere samfunnsmedlemmer og videreutvikle deres spatiotemporal fordeling i det naturlige miljøet. Ikke desto mindre har den siste innsatsen understreket betydningen av romlig organisering på fellesskapsfunksjonen og peker på behovet for å redegjøre for både medlemmens overflod og organisasjon i løpende studier 2 , 3 , 4 .
DenDet er klart at det lokale kjemiske miljøet ( dvs. tilgjengeligheten av næringsstoffer og sekundære metabolitter), den fysiske strukturen ( f.eks. Jordarkitektur, planterøtter, havpartikler eller tarmmilvilli), tilstedeværelse eller fravær av oksygen og innføring av Patogene arter har alle innvirkning på sammensetning, arkitektur og funksjon av mikrobielle samfunn 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Likevel fortsetter tradisjonelle teknikker for kulturer som forsømmer å fange disse faktorene seg. Fellesskapssammensetning ( f. Eks. Tilstedeværelse av medavhengige arter), fysisk vedlegg, signalmolekylkonsentrasjon og direkte cellecellekontakt er alle viktige faktorer for å forme et mikrobiell samfunn og kan gå tapt i cUventede kulturbetingelser. Disse egenskapene er vanskelige å replikere i en bulkvæskekultur eller på en agarplate. Tilgjengeligheten av mikrofluidiske, mikropatterings- og nanofabrikasjonsteknikker som tillater replikering av viktige fysiske og kjemiske egenskaper i naturlige miljøer, har imidlertid gjort det mulig for mange forskere å bygge bakteriefællesskaber for å studere deres interaksjoner 12 , 13 , 14 og å utvikle syntetiske miljøer som Etterligne naturlige forhold 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Denne protokollen beskriver en metode for å fremstille en mikrowell array-enhet og gir detaljerte eksperimentelle prosedyrer som kan brukes til å fungere som funksjonalitetE brønner i matrisen og å vokse bakterier, både som single-species kolonier og i multi-medlemmiljøer. Dette arbeidet demonstrerer også hvordan bakterier som er modifisert for å produsere fluorescerende reporterproteiner, kan brukes til å overvåke bakteriell vekst i brønner over tid. En lignende matrise ble presentert tidligere og viste at det er mulig å spore veksten av enkeltartskolonier av Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) i mikrobrønner. Ved å modulere brønnstørrelse og seedetthet kan startbetingelsene for tusenvis av veksteksperimenter varieres parallelt for å bestemme hvordan de første inokulasjonsbetingelsene påvirker bakteriens evne til å vokse 21 . Nåværende arbeid bruker en litt modifisert versjon av mikrowell-arrayet som bygger på det forrige arbeidet ved å muliggjøre samtidig sammenligning av flere arrays og ved å bruke en mer robust eksperimentell protokoll. Arrayet som brukes i dette arbeidet inneholder flere undergrupper, eller array ensemBles, som inneholder brønner av forskjellige størrelser, varierer fra 15 til 100 μm i diameter, som er arrangert på tre forskjellige steder ( dvs. 2x, 3x og 4x brønndiameteren). Arrayene er etset i silisium, og veksten av bakteriene som er sådd i silisiumsammensetningene, aktiveres ved å forsegle arrays med en deksel som er belagt med en middelsinfisert agarosegel. P. aeruginosa mutanter designet for å studere type VI sekresjonssystemet benyttes i denne demonstrasjonen.
Resultatene som presenteres her, bygger mot det endelige målet å analysere multimember-fellesskap innenfor mikrowell-arrays, slik at forskere kan overvåke overflod og organisering av bakterier in situ mens de kontrollerer og prober det kjemiske miljøet. Dette skal i siste instans gi innsikt i "reglene" som styrer samfunnsutvikling og suksess.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterte en mikrowell array-enhet og eksperimentelle protokoller som er utformet for å muliggjøre høy gjennomstrømning og høy innholds-levende celle-bildebasert analyse av bakteriell samfunnsutvikling. Mens demonstrasjonsfokuset her var å studere effekten av kontaktmidlet type VI-sekresjon på samfunnsutvikling, var arrays utformet for å være fleksible og imøtekomme studiet av et bredt spekter av mikrobielle samfunn og mikrobe-mikrobe-interaksjoner. Arbeidet her fokuserer utelukkende på bru…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microwell-arrays ble produsert og karakterisert ved Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Finansiell støtte til dette arbeidet ble gitt gjennom Oak Ridge National Laboratory Director's Research and Development Fund. Forfatterne vil også takke J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) for tilførsel av P. aeruginosa- stammer brukt i disse studiene.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
