Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos
Summary
El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores, incluyendo la arquitectura ambiental, la abundancia de los miembros, los rasgos y las interacciones. Este protocolo describe un ambiente sintético y microfabricado para el seguimiento simultáneo de miles de comunidades contenidas en pozos de femtoliter, donde factores clave como el tamaño de nicho y el confinamiento pueden ser aproximados.
Abstract
El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores deterministas y estocásticos complejos que pueden alterar drásticamente la distribución espacial y las actividades de los miembros de la comunidad. Hemos desarrollado una plataforma de matriz de micropocillos que se puede utilizar para montar y rastrear rápidamente miles de comunidades bacterianas en paralelo. Este protocolo destaca la utilidad de la plataforma y describe su uso para supervisar ópticamente el desarrollo de comunidades simples de dos miembros dentro de un conjunto de matrices dentro de la plataforma. Esta demostración utiliza dos mutantes de Pseudomonas aeruginosa , parte de una serie de mutantes desarrollados para estudiar la patogenicidad de la secreción de Tipo VI. Las inserciones cromosómicas de los genes mCherry o GFP facilitan la expresión constitutiva de proteínas fluorescentes con distintas longitudes de onda de emisión que pueden usarse para monitorear la abundancia y ubicación de los miembros de la comunidad dentro de cada micropocillo. Este protocolo describe una metodologíaD para ensamblar mezclas de bacterias en los pocillos de la matriz y usar imágenes de fluorescencia en intervalos de tiempo y análisis cuantitativo de imágenes para medir el crecimiento relativo de cada población miembro a lo largo del tiempo. Se discute la siembra y el ensamblaje de la plataforma de micropocillos, los procedimientos de imagen necesarios para el análisis cuantitativo de las comunidades microbianas dentro de la matriz y los métodos que pueden usarse para revelar interacciones entre el área de las especies microbianas.
Introduction
Las comunidades microbianas están formadas por factores deterministas, como la estructura del medio ambiente y los procesos estocásticos, que están asociados con la muerte celular, la división, la concentración de proteínas, el número de organelos y la mutación 1 . Dentro del entorno natural, puede ser casi imposible analizar el impacto individual de estas influencias en la composición y actividad de la comunidad. Obscurecido por las estructuras naturales y enterrado dentro de un medio químico y biológico, la identificación de los miembros de la comunidad y la resolución de su distribución espaciotemporal en el medio ambiente natural es extremadamente difícil. Sin embargo, los esfuerzos recientes han subrayado la importancia de la organización espacial en la función de la comunidad y señalan la necesidad de tener en cuenta tanto la abundancia como la organización de los miembros en los estudios en curso 2 , 3 , 4 .
Eso( Es decir, la disponibilidad de nutrientes y metabolitos secundarios), la estructura física ( por ejemplo, la arquitectura del suelo, las raíces de las plantas, las partículas oceánicas o los microvellos intestinales), la presencia o ausencia de oxígeno y la introducción de Las especies patógenas afectan a la composición, la arquitectura y la función de las comunidades microbianas 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Sin embargo, las técnicas tradicionales para las culturas que descuidan capturar estos factores continúan prevaleciendo. La composición de la comunidad ( por ejemplo, la presencia de especies co-dependientes), la unión física, la concentración de la molécula de señalización y el contacto directo célula-célula son factores importantes para formar una comunidad microbiana y pueden perderse en cCondiciones de cultivo convencionales. Estas propiedades son difíciles de replicar en un cultivo líquido a granel o en una placa de agar. Sin embargo, la disponibilidad de técnicas microfluídicas, micropatternas y de nanofabricación que permiten la replicación de características físicas y químicas claves de entornos naturales ha permitido a muchos investigadores construir comunidades bacterianas para estudiar sus interacciones 12 , 13 , 14 y desarrollar ambientes sintéticos que Imitan las condiciones naturales 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Este protocolo describe un método para fabricar un dispositivo de matriz de micropocillos y proporciona procedimientos experimentales detallados que se pueden utilizar paraE en la matriz y para cultivar bacterias, tanto como colonias de una sola especie como en comunidades de múltiples miembros. Este trabajo también demuestra cómo se pueden usar bacterias modificadas para producir proteínas informadoras fluorescentes para monitorear el crecimiento bacteriano dentro de los pozos con el tiempo. Una matriz similar se presentó anteriormente y mostró que es posible rastrear el crecimiento de colonias de una sola especie de Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) en micropocillos. Mediante la modulación del tamaño del pocillo y la densidad de siembra, las condiciones de partida de miles de experimentos de crecimiento se pueden variar en paralelo para determinar cómo las condiciones de inoculación inicial afectan a la capacidad de crecimiento de las bacterias 21 . El trabajo actual utiliza una versión ligeramente modificada de la matriz de micropocillos que se basa en el trabajo anterior, permitiendo la comparación simultánea de múltiples matrices y utilizando un protocolo experimental más robusto. La matriz utilizada en este trabajo contiene múltiples subarrays, o array ensemQue contienen pozos de diferentes tamaños, que van desde 15 – 100 μm de diámetro, que están dispuestos en tres pasos diferentes ( es decir , 2x, 3x y 4x el diámetro del pozo). Las matrices se graban en silicio y el crecimiento de las bacterias sembradas en las matrices de silicio se habilita sellando las matrices con un cubreobjetos que se ha recubierto con un gel de agarosa con infusión media. Los mutantes de P. aeruginosa diseñados para estudiar el sistema de secreción de Tipo VI se usan en esta demostración.
Los resultados presentados aquí se construyen hacia el objetivo final de analizar las comunidades de múltiples miembros dentro de las matrices de micropocillos, lo que permite a los investigadores para controlar la abundancia y la organización de las bacterias in situ mientras controla y sondeo del entorno químico. Esto, en última instancia, ofrecerá información sobre las "reglas" que rigen el desarrollo y la sucesión de la comunidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se presentó un dispositivo de matriz de micropocillos y protocolos experimentales diseñados para permitir el análisis de alta capacidad y alto contenido de células vivas basados en imágenes del desarrollo de la comunidad bacteriana. Si bien el objetivo de la demostración aquí fue estudiar los efectos de la secreción de tipo VI mediada por contacto en el desarrollo de la comunidad, los arrays fueron diseñados para ser flexible y acomodar el estudio de una amplia gama de comunidades microb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las matrices de micropocillos se fabricaron y caracterizaron en la División de Instalaciones de Usuarios del Centro de Ciencia de Materiales de Nanofase, Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Departamento de Energía de los Estados Unidos. El apoyo financiero para este trabajo se proporcionó a través del Fondo de Investigación y Desarrollo del Director del Laboratorio Nacional de Oak Ridge. Los autores también desean agradecer al Laboratorio J. Mougous (Universidad de Washington, Seattle, WA) por el suministro de cepas de P. aeruginosa usadas en estos estudios.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
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