Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse
Summary
Peptidkonkurrenceanalyser anvendes i vid udstrækning i en række molekylære og immunologiske eksperimenter. Dette papir beskriver en detaljeret fremgangsmåde til et in vitro oligopeptidkompeterende kinaseassay og de tilhørende valideringsprocedurer, som kan være nyttige til at finde specifikke phosphoryleringssteder.
Abstract
Proteinphosphorylering på bestemte steder bestemmer dets konformation og interaktion med andre molekyler. Proteinphosphorylering påvirker således biologiske funktioner og egenskaber hos cellen. For øjeblikket er den mest almindelige metode til opdagelse af phosphoryleringssteder ved hjælp af væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse, en hurtig og følsom metode. Imidlertid frigives relativt labile phosphatdele ofte fra phosphopeptider under fragmenteringstrinnet, hvilket ofte giver falske negative signaler. I sådanne tilfælde ville et traditionelt in vitro kinase assay ved anvendelse af stedregistrerede mutanter være mere præcist, men denne metode er besværlig og tidskrævende. Derfor kan en alternativ metode ved anvendelse af peptidkonkurrence være fordelagtig. Konsensusgenkendelsesmotivet for 5'-adenosinmonophosphat-aktiveret proteinkinase (AMPK) er blevet etableret 1 og blev valideret ved anvendelse af et positionsscanningpeptid bibliotek assAy 2 . Således kan AMPK-phosphoryleringssteder for et nyt substrat forudsiges og bekræftes af peptidkonkurrenceanalyserne. I denne rapport beskriver vi de detaljerede trin og procedurer for det in vitro oligopeptidkompeterende kinasassay ved at illustrere AMPK-medieret nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2) phosphorylering. For at autentificere phosphoryleringsstedet gennemførte vi et sekventielt in vitro kinase assay ved anvendelse af en site-specifik mutant. Samlet set tilvejebringer peptidkonkurrenceassayet en fremgangsmåde til screening af multiple potentielle phosphoryleringssteder og for at identificere steder til validering af phosphoryleringsstedsmutanterne.
Introduction
Proteinphosphorylering ved en specifik rest spiller en væsentlig rolle i en bred vifte af cellulære processer. En forståelse af signaleringsnetværk kræver således identifikation af specifikke phosphoryleringssteder. Derudover bestemmer phosphoryleringsstedet virkningen på proteinfunktionen, fordi individuelle domæner i et protein har forskellige strukturer og funktioner. Aktiviteten af nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2), en nøgle antioxidant transkriptionsfaktor, reguleres tovejs gennem phosphorylering på forskellige steder. Vores studier har fokuseret på kinaser, der katalyserer phosphoryleringen af Nrf2. Spændingsresponsen af Nrf2 mod oxidativ udfordring sker hurtigt, hovedsagelig gennem phosphorylering ved serin 40 og formidlet af proteinkinase C (PKC) -δ, som aktiverer Nrf2 3 , 4 . Omvendt katalyserer Fyn den inhibitoriske phosphorylering af Nrf2 ved tyrosin 568 for tæt kontrol af aktiviteten 5 .
Den mest almindelige metode, der anvendes til at opdage phosphoryleringssteder, er væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse. Hurtige og meget følsomme phosphoryleringssteder mapping data kan genereres på denne måde; Det har dog flere tekniske begrænsninger, der ofte genererer falsk-negative signaler. Dårlig sekvensdækning forekommer ofte i LC / MS analyse. For at identificere phosphoryleringssteder kræves der information om den maksimale aminosyredækning af et protein 6 . Proteolyse af proteinet af interesse med flere proteaser under fordøjelsestrinnet kan være til hjælp til forbedring af sekvensdækning. En anden hindring for identifikationen af phosphoryleringsrester er det letforløb af phosphorsyre, som ofte observeres for serin- og threoninphosphorylerede peptider 6 , 7 . Labile phosphatdele er ofteFrigivet fra phosphopeptider under fragmenteringsprocessen 7 . Den anden mulighed, når man søger efter phosphoryleringssteder, bruger en peptidmikroarray metode. Det er muligt at screene for kinase-målstederne ved anvendelse af en mikroarraychip indeholdende peptidfragmenter afledt af et protein af interesse. På grund af udstyrets krav til produktion og påvisning af en microarray-chip betragtes peptid-mikroarray-metoden imidlertid tidskrævende og dyr.
For at overvinde disse udfordringer kan et in vitro oligopeptidkompeterende kinaseassay anvendes til en proteinkinase med kendte genkendelsesmotiver. Hvis konsensusgenkendelsesmotivet for en kinase er etableret, kan der forudses formodede phosphoryleringssteder for et kandidatsubstrat, og autentiteten af lokaliteterne kan valideres. Den mest overbevisende metode til denne procedure er at vise ophævelsen af phosphorylering i et mutantprotein, hvori den predicteD rest er substitueret med en ikke-phosphorylerbar aminosyre ( dvs. serin eller threonin til alanin; tyrosin til phenylalanin). Imidlertid er produktion og isolering af mutante proteiner tidskrævende. Som et alternativ i den indledende fase af undersøgelsen er den konkurrencedygtige peptidkinaseanalyse ligetil og bekvem. Her beskriver vi en protokol for en in vitro -peptidkonkurrenceanalyse og til validering af phosphoryleringsstedet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som en enkel og bekvem måde til at vurdere ægtheden af de forudsagte phosphoryleringssteder medieret af AMPK beskriver vi her et in vitro kinase assay, der kan anvendes til at opdage et specifikt phosphoryleringssted ved anvendelse af konkurrencedygtige peptider og for at verificere det ved anvendelse af en site-specifik mutant . De repræsentative data opnået fra det in vitro- konkurrencedygtige AMPK-aktivitetsassay matchede resultaterne fra et assay ved anvendelse af et site-rettet mutantpro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 og nr. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
