Nous présentons un protocole pour isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux dérivé qui représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent être isolés rapidement, ne nécessitent pas dans le traitement in vitro et, par conséquent, peut être utilisé pour prévascularisation une étape dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire.
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Article de méthode
Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l'ingénierie tissulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un réseau microvasculaire fonctionnelle est d'une importance cruciale pour la survie et l'intégration des constructions de tissu d'ingénierie. A cet effet, plusieurs stratégies angiogéniques et prévascularisation ont été mis en place. Cependant, la plupart des approches basées sur les cellules comprennent chronophages étapes in vitro pour la formation d'un réseau microvasculaire. , Ils ne sont donc pas adaptés pour peropératoires procédures en une seule étape. fragments microvasculaires adipeuses dérivées de tissu (ad MVF) représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent facilement être isolées à partir de tissu adipeux et présentent une morphologie fonctionnelle microvaisseaux. De plus, ils réassembler rapidement dans de nouveaux réseaux microvasculaires après l' implantation in vivo. En outre, ad-MVF ont été montré pour induire lymphangiogenèse. Enfin, ils sont une riche source de cellules souches mésenchymateuses, qui peut en outre contribuer à leur fort potentiel de vascularisation. Dans des études précédentes, nous avons démontré la vascularizati remarquablesur la capacité d'ad-MVF dans l'os d'ingénierie et de substituts cutanés. Dans la présente étude, nous présentons un protocole standardisé pour l'isolement enzymatique ad-MVF de tissu adipeux de souris.
Introduction
L' ingénierie tissulaire se concentre sur la fabrication de produits de remplacement de tissus et d' organes qui maintenir, rétablir ou d' augmenter la fonction des inopérable homologues in vivo 1, 2. Le sort des constructions de l' ingénierie tissulaire dépend essentiellement d' une vascularisation adéquate 3. Réseaux microvasculaires au sein de ces constructions doivent être organisés hiérarchiquement avec artérioles, capillaires et veinules pour permettre la perfusion sanguine efficace après anastomose à la vasculature du bénéficiaire 4....
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Protocole
Toutes les procédures ont été effectuées selon l'Institut national des directives de santé pour l'utilisation des animaux de laboratoire et ont suivi les directives institutionnelles (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Sarrebruck, Allemagne).
1. Préparation des instruments chirurgicaux
- Tenir prêt les ciseaux de dissection, des pinces chirurgicales, des petits ciseaux de préparation, une pince fine et une boîte de Pétri stérile avec un milieu de Eagle modifié par 15 mL Dulbecco (DMEM, 10% de sérum de veau foetal (SVF), 100 U / ml de pénicilline,....
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Résultats
Dans la présente étude, nous avons effectué six procédures d'isolement ad MVF avec le tissu adipeux de 7 à 12 mois vieux mâle de type sauvage C57BL / 6 souris (poids corporel moyen: 35 ± 1 g). La figure 1 illustre la récolte des plaquettes murines de graisse épididymaire avec l' isolation ad-MVF mécanique et enzymatique subséquente. Le temps nécessaire à la récolte de matières grasses était de 30 minutes et pour l'isolement des ad-MVF était de 120 min. Au tot.......
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Discussion
Dans cette étude, nous présentons un protocole bien établi pour l'isolement des ad-MVF. L'obtention ad-MVF du tissu adipeux de souris est une procédure simple avec quelques étapes critiques. Les souris présentent différents dépôts de graisse sous-cutanée et intra-abdominales. Comme précédemment décrit pour les rats, la source de matières grasses la plus appropriée pour l'isolement de l' ad-MVF sont les coussinets adipeux épididymaire en raison de leur taille, de structure homogène et une contamination mi.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants pour l'excellente assistance technique de Janine Becker, Caroline Bickelmann et Ruth Nickels. Cette étude a été financée par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fondation allemande pour la recherche) - LA 2682 / 7-1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube à microcentrifuger conique de 1,5 mL | VWR, Kelsterbach, Allemagne | 700-5239 | |
| 100-µ ; Pipette de précision L | Eppendorf, Hambourg, Allemagne | Pipette | |
| 10 ml | Costar, Corning Inc., New York, États-Unis | 4488 | |
| Tubes en PP de 14 ml | Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne | 187261 | |
| Pipette de précision de 1 ml | Eppendorf, Hambourg, Allemagne | 4920000083 | |
| 500-µ ; m filtre (pluriStrainer 500 µ ; m) | HISS Diagnostics, Fribourg, Allemagne | 43-50500-03 | |
| Tube à centrifuger conique de 50 mL | Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne | 227261 | |
| Fiole Erlenmeyer de 50 mL | VWR, Kelsterbach, Allemagne | 214-0211 | |
| Plaque à 96 puits | Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne | 65518 | |
| solution de détachement de cellules (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA États-Unis | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 souris | Charles River, Cologne, Allemagne | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J souris | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, États-Unis | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | 553354 | |
| Collagénase NB4G ; | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Allemagne | 17465.02 | Lot testé par le fabricant pour l’activité enzymatique |
| Ciseaux de dissection | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Allemagne | BC 601 | |
| Colorant de liaison à l’ADN (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne | B2261 | |
| Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) ; | PAN Biotech, Rickenbach, Allemagne | P04-03600 | |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Allemagne | S0615 | |
| Pinces fines | S& T AG, Neuhausen, Suisse | FRS-15 RM-8 | |
| Ciseaux fins | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, États-Unis | 503261 | |
| Substitut cutané (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Kétamine ; | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Allemagne | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 ; ; | eBioscience, San Diego, CA États-Unis | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (solution désinfectante) | Schü ; lke & Mayer, Norderstedt, Allemagne | 118211 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Biochrom, Berlin, Allemagne | A2213 | |
| Boîte de Pétri | Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne | 664160 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Lonza Group, Bâle, Suisse | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µ ; m (20 & micro ; m filtre) | HISS Diagnostics, Fribourg, Allemagne | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | 553930 | |
| Petits ciseaux de préparation | S& T AG, Neuhausen, Suisse | SDC-15 R-8S | |
| Pince chirurgicale | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Allemagne | BD510R | |
| Ruban adhésif (Heftpflaster Seide) 1,25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Allemagne | 1671801 | |
| Xylazine ; | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Allemagne | 1320422 | |
| &alpha ;-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA États-Unis | 53-9760-82 | L’étiquetage intracellulaire nécessite en outre Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne ; #554722) |
Références
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J.
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Réimpressions et autorisations
