نقدم بروتوكول لعزل الدهنية شظايا الاوعية الدموية الدقيقة المستمدة من الأنسجة التي تمثل وحدات الأوعية الدموية واعدة. أنها يمكن أن تكون معزولة بسرعة، لا تتطلب في تجهيز المختبر، وبالتالي يمكن استخدامها لprevascularization خطوة واحدة في مختلف مجالات هندسة الأنسجة.
شبكة الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية ذات أهمية محورية لبقاء والتكامل من بنيات الأنسجة هندسيا. لهذا الغرض، وقد وضعت عدة استراتيجيات عائية وprevascularization. ومع ذلك، وتشمل معظم النهج القائمة على الخلايا في المختبر الخطوات تستغرق وقتا طويلا لتشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. وبالتالي، فهي ليست مناسبة لإجراءات خطوة واحدة أثناء العملية. الدهنية المشتقة من الأنسجة شظايا الاوعية الدموية الدقيقة (إعلان MVF) تمثل وحدات الأوعية الدموية واعدة. أنها يمكن أن تكون معزولة بسهولة من الأنسجة الدهنية ويحمل التشكل microvessel وظيفية. وعلاوة على ذلك، فإنها يحشدوا بسرعة إلى شبكات الاوعية الدموية الدقيقة جديدة بعد زرع في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أن إعلان MVF للحث على lymphangiogenesis. وأخيرا، فهي مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة، والتي قد تزيد من إمكانية المساهمة في الأوعية الدموية العالية. في دراسات سابقة أننا أظهرنا في vascularizati رائععلى قدرة إعلان MVF في هندسة العظام والجلد بدائل. في هذه الدراسة، ونحن التقرير على بروتوكول موحد لعزل الأنزيمية للإعلان MVF من الأنسجة الدهنية في الفئران.
وتركز هندسة الأنسجة في تصنيع الأنسجة والأعضاء البديلة التي تحتفظ، استعادة أو زيادة وظيفة غير صالحة للعمل في نظرائهم الجسم الحي 1 و 2. مصير يبني الأنسجة المهندسة يعتمد بشكل حاسم على الأوعية الدموية كافيا 3. شبكات الاوعية الدموية الدقيقة داخل هذه ثوابت ينبغي تنظيم هرمي مع الشرايين، الشعيرات الدموية، والأوردة للسماح كفاءة الارواء الدم بعد مفاغمة إلى الأوعية الدموية المستلم 4. الجيل من هذه الشبكات هو من بين التحديات الرئيسية في هندسة الأنسجة. لهذا الغرض، تم تقديم مجموعة واسعة من الاستراتيجيات الأوعية الدموية التجريبية على مدى العقدين الماضيين 5، 6.
النهج عائية تحفيز النمو الداخلي من microvessels المتلقي إلى TISS هندسياUES عن طريق الهيكلي أو الفيزيائية تعديل سقالة، مثل إدماج عوامل النمو 7. ومع ذلك، من أجل الأوعية الدموية من بنيات كبيرة ثلاثية الأبعاد والاستراتيجيات التي تعتمد على الأوعية الدموية تقتصر بشكل ملحوظ بنسب نمو بطيئة تطوير microvessels 8.
في المقابل، فإن مفهوم prevascularization يهدف لتوليد شبكات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية في غضون الأنسجة يبني قبل ترسيخها على 9. ينطوي prevascularization التقليدية وثقافة مشتركة من الخلايا المكونة للسفينة، مثل الخلايا البطانية، والخلايا الجدارية أو الخلايا الجذعية 10، ضمن السقالات. بعد تشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة، ويمكن بعد ذلك يبني prevascularized يتم زرعها في عيوب الأنسجة. الجدير بالذكر أن هذا النهج prevascularization يصعب تطبيقه في عملية إعداد سريرية، لأنه يقوم على معقدة وتستغرق وقتا طويلا في المختبر </ م> الإجراءات التي تم منعها من قبل العقبات التنظيمية الرئيسية 9. وبناء على ذلك، لا يزال هناك حاجة لتطوير استراتيجيات prevascularization الرواية التي هي أكثر ملاءمة لتطبيق السريرية واسع.
قد تكون هذه الاستراتيجية prevascularization تطبيق شظايا الاوعية الدموية الدقيقة المستمدة من الأنسجة الدهنية (إعلان MVF). إعلان MVF تمثل وحدات الأوعية الدموية القوية التي يمكن حصادها في كميات كبيرة من الأنسجة الدهنية من الفئران 11 و 12 و 13 الفئران. وهي تتألف من تصلب، الشعرية، وشرائح سفينة venular، الذي يحمل التشكل microvessel الفسيولوجية مع التجويف وتحقيق الاستقرار في الخلايا المحيطة بالأوعية 14 و 15. تسمح هذه الميزة الفريدة غرس فوري من السقالات الإعلان MVF المصنف إلى عيوب الأنسجة دون precultivation. هناك، وإعلان MVF يحشدوا بسرعة فيإلى شبكات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية. وعلاوة على ذلك، شبيه MVF تمثل مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة 16، والتي قد تسهم بالإضافة إلى القدرة على التجدد ضرب بهم. وفقا لذلك، وتستخدم إعلان MVF على نحو متزايد في مختلف مجالات هندسة الأنسجة 14 و 15 و 17 و 18 و 19 و 20 و 21.
وقد أنشئت أصلا عزلة إعلان MVF في الفئران 11 و 12. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يسمح للعزلة موحدة من الفئران إعلان MVF من منصات الدهون بربخي. وهذا قد تقدم مزيدا من الإيضاحات الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة إعلان MVF باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا.
في هذه الدراسة نقدم بروتوكول راسخة لعزل إعلان MVF. الحصول على إعلان MVF من الأنسجة الدهنية في الفئران هو إجراء بسيط مع عدد قليل من الخطوات الحاسمة. الفئران المعرض تحت الجلد المختلفة، ورواسب الدهون داخل البطن. كما هو موضح سابقا بالنسبة للفئران، ومصدر الدهون الأنسب لعزل إ…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون للمساعدة التقنية الممتازة جانين بيكر، كارولين بيكلمان وروث نيكيلس. وقد تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG – مؤسسة الأبحاث الألمانية) – LA 2682 / 7-1.
1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |