Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu
Summary
Bu umut verici vaskülarizasyon birimlerini temsil adipoz doku türevli mikrovasküler fragmanları izole etmek için bir protokol mevcut. Bunlar hızlı bir şekilde izole edilebilir, bu nedenle, doku mühendisliği farklı alanlarında tek aşamalı prevascularization için kullanılabilmektedir, nitro işleme gerektirmez ve yoktur.
Abstract
Fonksiyonel bir mikrovasküler ağ hayatta kalma ve mühendislik doku yapıları entegrasyonu için önemli bir önem taşımaktadır. Bu amaçla, çeşitli anjiyogenik ve prevascularization stratejileri kurulmuştur. Bununla birlikte, bir çok hücre-bazlı yaklaşımlar mikrovasküler ağı oluşumu için zaman alıcı, in vitro aşamaları içermektedir. Bu nedenle, bu operasyon sırasında tek aşamalı yöntemler için uygun değildir. Adipoz doku türevli mikrovasküler fragmanları (reklam MVF) umut vadeden vaskülarizasyon birimini temsil eder. Kolayca yağ dokusundan izole edilmiş ve bir işlevsel mikrodamar morfoloji sergiler edilebilir. Dahası, hızla in vivo implantasyonu sonrası yeni mikrovasküler ağlara yeniden birleştirmek. Ayrıca, reklam-MVF lemfanjiojenezi neden olduğu gösterilmiştir. Son olarak, daha da yüksek vaskülarizasyon etkisine de katkıda mezenkimal kök hücrelerin zengin bir kaynaktır. Daha önceki çalışmalarda biz olağanüstü vascularizati göstermiştirmühendislik kemik ve cilt ikame reklam-mvf kapasitesine. Bu çalışmada, biz fare yağ dokusundan reklam mvf enzimatik izolasyonu için standart bir protokol rapor.
Introduction
Doku mühendisliği, in vivo meslektaşları 1, 2 çalışamaz işlevini geri ya da takviye iddia ettikleri doku ve organ ikamelerinin üretim odaklanmaktadır. Mühendislik doku yapıları kaderi önemlisi yeterli vaskülarizasyon 3 bağlıdır. Bu yapılara içinde Mikrovasküler ağlar hiyerarşik alıcının damarsal 4'e kaynaştırma sonra verimli kan perfüzyonunu sağlamak için Arterioller, kapiller ve venüllerden ile düzenlenmelidir. Bu tür ağların nesil doku mühendisliğinde temel zorluklardan biridir. Bu amaçla, deneysel vaskülarizasyon stratejileri geniş spektrumlu son yirmi yılda 5, 6 üzerinde tanıtıldı.
Anjiojenik yaklaşımlar mühendislik Tiss içine alıcı mikrodamarlar içeri büyümesini teşvikBu tür büyüme dahil 7 faktörleri olarak yapısal ya da fiziko-kimyasal iskele modifikasyonu vasıtasıyla evet. Bununla birlikte, büyük bir üç boyutlu yapıları vaskülarizasyonu için, anjiyogenez-bağımlı stratejiler belirgin mikrodamarlar gelişmekte olan 8 yavaş büyüme oranları ile sınırlıdır.
Doku yerlefltirilifl 9 öncesinde inşa dahilinde aksine, prevascularization kavramı fonksiyonel mikrovasküler ağların nesil için hedefliyor. Geleneksel prevascularization bu iskeleler olan endotel hücreleri, duvar hücreleri veya kök hücreler 10 gibi kap oluşturan hücre, ko-kültür içerir. mikrovasküler ağ oluşturulduktan sonra prevascularized yapıları daha sonra doku defektlerinin implante edilebilir. Karmaşık ve zaman alıcı in vitro temel aldığı için dikkate değer, bu prevascularization yaklaşım, klinik ortamda uygulamak zordur </ em> önemli düzenleyici engeller 9 kısıtlandığı prosedürleri,. Bu duruma göre, geniş bir klinik uygulama için daha müsait olan yeni prevascularization stratejilerinin geliştirilmesi için hala bir ihtiyaç vardır.
Bu tür bir prevascularization stratejisi adipoz doku türevli mikrovasküler parçalarının (reklam MVF) uygulanması olabilir. Reklam-MVF sıçanlarda 11, 12 ve fareler 13 yağ dokusundan büyük miktarlarda hasat edilebilir kuvvetli vaskülarizasyon birimini temsil eder. Bunlar arteriyoler, kapiler ve bir lümen içeren bir fizyolojik mikrodamar morfolojisi sergileyen venüler damar bölümü ve stabilize edici perivasküler hücreleri 14, 15 oluşmaktadır. Bu benzersiz özellik Bakterinin yetişmesinden önceki süreye olmadan doku defektleri içine reklam MVF seribaşı iskelelerinin hemen implantasyonu verir. Orada, ad-MVF hızla içinde yeniden birleştirmekFonksiyonel mikrovasküler ağlara. Ayrıca, reklam MVF ilave olarak kendi çarpıcı rejeneratif kapasitesine katkıda mezenkimal kök hücrelerin 16, zengin bir kaynak oluşturmaktadır. Buna uygun olarak, reklam MVF artan doku mühendisliği 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 farklı alanlarında kullanılmaktadır.
Ad-mvf izolasyonu aslen 12 sıçanlarda 11 kurulmuştur. Bu yazıda, epididimal yağ pedleri gelen fare reklam mvf standardize izolasyonunu sağlayan bir protokol, açıklar. Bu transgenik fare modelleri kullanılarak reklam MVF fonksiyonu altında yatan moleküler mekanizmaların daha başka bilgi sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada reklam mvf izolasyonu için köklü bir protokol mevcut. fare adipoz dokudan reklam MVF edinme birkaç kritik adımlarla basit bir işlemdir. Fareler farklı subkutanöz ve karın içi yağ birikintilerini sergiler. Daha önce fareler için tarif edildiği gibi, reklam MVF izolasyonu için en uygun yağ kaynağı, daha büyük kan damarlarının 11 ile boyut, homojen bir yapı ve en az kirlenme, 12 epididimal yağ pedleri. Bunun aksine, farelerde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Janine Becker, Caroline Bickelmann ve Ruth Nickels mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. (- Alman Araştırma Vakfı DFG) – LA 2682 / 7-1 Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe ile finanse edildi.
Materials
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
