여기, 우리는 electroconvulsive 자극 후 쥐 해마에 새로운 뉴런의 형성과 그 생존을 계량하는 데 사용되는 stereological 방법, 광학 fractionator을 제시한다. 정확한 구현이 이루어질 때, 입체파 방법의 민감도와 효율성은 고정 된 미리 정해진 정밀도로 정확한 추정을 보장합니다.
Stereological 방법은 세포 또는 구조의 크기, 모양, 방향 및 분포에 대한 가정을하지 않고 정량적 매개 변수를 설명하도록 설계되었습니다. 이 방법은 포유류 뇌의 정량 분석에 혁명적인데, 체적 세포 집단이 너무 많아 수동으로 계산할 수 없으며, 입체 사진은 3 차원 양의 추정이 2 차원 측정에서 추출되어야 할 때마다 항상 선택 기술입니다 섹션. 모든 입체파 방법은 원칙적으로 편파적이다; 그러나 그들은 관심 구조와 조직의 특성에 대한 적절한 지식에 의존합니다. Stereology는 SURS (Systematic Uniformly Random Sampling)를 기반으로하며 정밀도 측면에서 가장 효율적인 수준으로 샘플링을 조정하여 전체 관심 구조에 대한 신뢰할 수있는 정량 정보를 제공합니다. 여기 우리는 BrdU 면역 조직 화학 t와 함께 광학 분별기를 제시o 신경 흥분제의 가장 강력한 자극제 중 하나 인 전기 경련 자극 후에 쥐 해마의 과립 세포층 (세립립 구역 포함)에서 새로 형성된 뉴런의 생성 및 생존을 평가한다. 광학 분별 기 기술은 전체 구조에서 샘플링 한 두꺼운 섹션의 총 셀 수를 추정 할 수 있도록 설계되었습니다. 두꺼운 섹션은 전체 3 차원 범위에서 세포를 관찰 할 수있는 기회를 제공하므로 형태 학적 기준에 따라 쉽고 강력한 세포 분류가 가능합니다. 정확하게 구현되면, 광학 분별 기의 감도 및 효율은 고정 된 사전 결정된 정확도로 정확한 추정치를 제공합니다.
3 차원 (3-D) 구조의 세포를 정량화하기 위해서는 편향되지 않은 원리에 기초하여 추정치를 얻어야 할 수도 있습니다. 오늘날에도 연구에서는 3 차원 구조의 데이터를보고하기 위해 2 차원 (2 차원) 방법을 자주 사용합니다. 그러나,이 방법들은 구조적 제한을 야기하는 세포의 모양 및 분포의 관점에서 구조의 이종 성질을 고려하지 않는다; 그들은 3D 관심 구조에 대한 가정을하고 결과는 완전한 구조를 언급하지 않는다. 이러한 제한은 오류의 위험을 증가시킬뿐만 아니라 방법의 민감도와 정확성을 감소시킵니다 1 .
세포 계수의 편차는 주어진 조직이나 구조에서 세포의 수에 대한 정량적 인 정보를 얻는 데 일반적으로 중요한 디자인 기반의 입체학의 적용으로 피할 수 있습니다. 입체파는 이전에는 매우 시간이 많이 걸리는 방법 이었지만, 절차의 진보, 부드러운도자기 및 이미징은 훨씬 더 효율적이고 광범위하게 적용될 수있게 만들었습니다. Stereology는 통계적 샘플링 원리와 확률 론적 기하학 이론을 사용하여 2 차원 섹션에서 샘플링하여 3 차원 구조의 물체, 표면적, 길이 및 객체 수를 추정하는 효율적인 도구를 제공합니다 2 . 따라서 입체 음향학은 철저한 분석없이 실제 수치의 평균 추정치를 제공하는 조직 절편의 구조적 변화에 대해 불편한 정량적 데이터를 얻을 수있게합니다 1 . Stereology는 샘플링 된 정보의 기하학적 매개 변수에 대한 통계적 추론으로 정의됩니다. 이것은 편파적 인 표본 추출, 즉 섹션의 체계적 무작위 표본 추출과 모든 물체가 동등한 확률을 갖도록하는 계수 규칙에 의해 달성 될 수 있습니다 3 . 입체 결과는 오류 계수 (CE)로 표시된 것과 같이 다양한 정도의 정밀도를 가질 수 있지만, 이는 광고 일 수 있습니다필요에 따라 샘플링 양을 조정하여 내재 된 생물학적 분산 (CV)에 맞게 조정할 수 있습니다. 이전의 몇몇 입체적인 연구에서 설치류 6, 7의 해마 가소성에 대한 전기 충격 자극 (electroconvulsive stimulation, ECS)의 단기 효과를 조사했습니다. 이들 연구의 데이터는 반복 된 ECS 후 상승 된 시냅스 분화뿐만 아니라 뉴런의 총 수의 초기 증가를 나타낸다. 그러나,이 연구는 세포 증식에 특정 마커를 사용하지 않기 때문에 신경 발생을 직접적으로 추정하지 못합니다.
여기에 입체적 방법의 응용, 광학 세분화 기술 8,9 , 하위 낟알 영역 (SGZ)을 포함하여 쥐의 hippocampal 과립 세포 레이어 (GCL)에 새로 형성된 뉴런의 총 수뿐만 아니라 장기적으로우화 10 , 11 . 우리는 쥐에게 신경 발생의 가장 강력한 자극제 중 하나 인 ECS의 임상 관련 일정 (3 주 동안 일주일에 3 번)을 실시했습니다 12 . 대조군 동물을 동일한 절차를 사용하여 처리하였으나, 전류는 통과시키지 않았다. 실험 21 일 째, 모든 쥐에게 세포 분열 동안 티미 딘 대신에 DNA에 통합 된 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU)을 복강 내 주사 하였다. 실험 후, 래트를 4 개의 상이한 기간 (24 시간, 3 달, 6 달 및 12 달) 동안 유지시켰다. 분별 기 원리를 사용하여 섹션의 균일 무작위 샘플링을 통해 해마의 알려진 분획을 얻었으며 표본 추출 및 면역 염색 된 두꺼운 조직 섹션에 광학 장애 (3-D 프로브)를 적용했습니다. 고정 된 섹션은 일반적으로 프로세스 중에 z 축에서 축소됩니다가중 평균 단면 두께에 기초한 광학적 장애가이 특별한 경우에 사용되어야한다고 주장했다. 광학적 장애물의 초점 평면이 단면을 통해 알려진 거리만큼 아래로 이동함에 따라, BrdU 양성 뉴런은 관심 대상의 특징이 명확하게 인식 될 때 계산됩니다. 입체 음향학의 분야에서 계수되어야하는 총 입자 수에 관한 몇 가지 논쟁이있다. 일반적으로 150-200 개의 신경 세포가 적절한 정밀도, 즉 7-8 %의 계수를 얻기 위해 관심 구조에 포함됩니다. BrdU 양성 뉴런 카운트는 카메라가 장착 된 표준 현미경 및 2 배, 4 배 및 10 배뿐만 아니라 100 배 오일 침지 대물 렌즈 (개구 수 = 1.40) 및 동력 스테이지 . z 방향의 움직임은 디지털 마이크로 케이 터로 측정되었습니다. 최종 배율3000X였습니다.
neurogenesis를 유도하는 방법론으로 ECS를 사용하여 우리는 해마에 새로운 BrdU 양성 뉴런의 형성에 즉각적인 260 %의 증가를 발견했습니다. 이 급격하게 생성 된 뉴런 풀에서 우리는 1 일에서 3 개월 사이에 40 %의 마비를 발견했으며, 새로 형성된 뉴런의 거의 50 %가 치료 후 최소 12 개월 생존했다. BrdU로 표지 된 뉴런의 계수는 엄격한 표본 추출 방식을 따랐으며, 전체 해마는 80μm 두께로 자른 다음 매 5 번째 섹션의 하위 샘플링을 한 후 섹션 1과 섹션 5 사이에서 무작위 추출을 시작했습니다. 이 섹션을 제공하는 것은 체계적으로 무작위로 선택됩니다. 이것은 철저한 계산없이 최종 결과의 분산을 줄이는 데 훌륭한 방법입니다. 이 표본 추출 방법을 통해 BrdU 양성 뉴런을 평균 12 (8-16) 마리의 해마각 쥐 두뇌의 알 섹션, 9-11 %의 최종 정밀도.
분별 기법을 사용할 때는 조직 수축 및 변형이 조직 학적 과정에서 자주 발생하기 때문에 계수를 수행하는 단면 높이의 분율을 알아야합니다. 사실,이 연구에서 두께의 상당한 축소를 보았습니다. 또한, Dorph-Petersen et al.에서 제시된 것처럼, 상이한 조직 수축이 발생할 수 있음을 주목해야한다. 그러나 완전한 구조의 분석이 가능하다면, 이러한 제한은 총 입자 수 즉 BrdU 양성 뉴런의 편향을 초래하지는 않는다. 조직 수축이 특별한 문제인 연구에서, 결과는 변형 된 조직에서 얻어지는 것이 항상 언급되어야합니다. 이 연구에서, 우리는 10 μm의 분열기 높이에서 세었다. 본 연구의 섹션은 최종 평균 두께가 26 μm, 5 μm가드 구역과 섹션 하단의 11-μm (평균) 가드 구역으로 구성됩니다. 가드 존은 대략 샘플링 된 입자의 직경이어야하기 때문에 이러한 매개 변수를 사용할 수 있습니다.
GCL / SGZ의 묘사에 따라, 장애물은 묘사 된 영역 내에 균일하게 무작위로 배치되었습니다. 장애가는 조사자가 결정한 정확도로 견적을 효율적으로 얻기 위해 표본 추출 및 계산을 최적화하는 고정 된 단계 길이로 배치되어야합니다. 최적의 정확도는 일반적으로 각 관심 구조의 셀을 150-200 셀까지 계산하여 얻을 수 있습니다 5 . 현재 연구에서, 우리는 각각의 쥐 해마에 BrdU 양성 뉴런 133 개 (범위 33-372)의 평균을 세었다. 일부 동물에서는 세포 수가 적기 때문에 BrdU 양성 뉴런의 수는 적절한 정밀도를 얻기 위해 필요한 일반적으로 수용 가능한 세포 수보다 낮아져 이러한 경우에 대해 상대적으로 높은 CE 값을 나타냈다. H그러나 우리가 CV 값의 절반보다 적은 CE 값을 얻었을 때 (대표 결과 섹션 참조) 추가 샘플링 및 계산이 필요하지 않았습니다. CV 값이 높으면 관찰 된 편차에 가장 큰 기여를하는 것은 생물학적 변이에 기인 한 것으로 나타났다. 사실, 우리는 현재 연구에서 계산 된 BrdU 양성 뉴런의 평균 수가 필요 이상으로 높았다 고 주장 할 수있다. 예를 들어, 한 그룹의 래트에서 우리는 9 %의 CE 값을 얻었으며, 43 %의 CV 값을 보았습니다. 이 특별한 경우에, 우리는 약 20 %의 정밀도를 목표로 할 수있었습니다. 요약하면, 현재 연구에서 BrdU 양성 뉴런의 총 수의 정확성은 입자의 실제 수에 대한 실제 치료 효과를 포착하기에 충분합니다. 특정 동물 군에서 다소 큰 생물학적 다양성으로 인해, 노력의 지출은 적더라도 동일한 견적을 허용 가능한 정밀도로 얻을 수있었습니다. 그룹 내의 높은 생물학적 차이는동물의 수를 늘림으로써 보상을 받는다.
정확한 세포 수를 얻기위한 황금 표준은 관심있는 모든 대상의 철저한 계산을 수반한다고 주장 할 수도 있습니다. 그러나 뇌의 대부분의 연구에서 이것은 방대한 수의 세포 때문에 가능하지 않습니다. 철저한 세포 계수보다 훨씬 효율적이지만 선택적 분별 기는 정확한 세포 수가 필수적이지 않은 경우 선호되는 세포 수의 차이를 간단히 스크리닝하는 것과 비교할 때 비교적 시간이 많이 소요됩니다. 20-30 % 이상의 차이점을 순차적으로 스크리닝 절차를 통해 감지 할 수있는 것은 우리의 경험입니다.
올바르게 수행 된 경우, 설계 기반의 입체 시학을 사용한 샘플링은 효율적인 방법으로 비 편향적이고 정확한 추정을 제공합니다 1 . 입체 시학의 불편한 성질은 복제 될 때, 실제 모집단 평균을 근사하고,견적 21 . 처음에는 관심있는 전체 구조 (이 연구에서는 해마 GCL / SGZ)의 대표 표본을 얻어야 통계적으로 유효한 섹션 4의 하위 집합에서 추정이 가능합니다. 적절한 수의 섹션 및 카운팅 프로브를 얻으려면 SURS를 적용하면 무작위 샘플링에 비해 편차가 줄어 듭니다 8 . 또한, SURS는 구조 내의 대상 입자가 구조의 크기, 모양, 방향 및 분포와 관계없이 동일한 확률로 샘플링되도록합니다. 정확하고 편견없는 추정치를 얻는 것이 프로젝트의 중심적인 측면 인 경우 이러한 입체 시학을 적극 권장합니다.
The authors have nothing to disclose.
숙련 된 기술 지원에 대해 Susanne Sørensen에게 감사드립니다. 이 작품은 Velux 재단의 보조금으로 지원되었습니다. 재샤 재단; Aase 및 Ejnar Danielsens 재단; 하트만 형제 재단; Jacob Madsen 감독과 아내 Olga Madsens 재단 박사 Sofus Carl Emil Friis와 아내 Doris Friis 'Trust; 1870 년의 기초; Torben과 Alice Frimodts Foundation 및 신경학 연구 재단. 원고 편집은 Inglewood Biomedical Editing에 의해 수행되었습니다.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |