JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt<em> In vitro</em> Kültürlü İnsan Primer Miyotları

Published: June 25, 2017
doi:
10.3791/55743
, , , , , ,
1CarMeN Laboratory, INSERM U1060, INRA 1397,University of Lyon, 2Department of digestive and bariatric surgery, Obesity Integrated Center, University Hospital of Edouard Herriot, Hospices Civils de Lyon,Lyon 1 University, 3Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Department of Clinical Medicine, Faculty of Medicine,University of Geneva

Summary

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Abstract

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı.

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.

Introduction

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir.

Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2'de tanıtıldı ve 3 , 4'den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür.

İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir.

Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16'nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir.

Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro </Em> modeli, insülin yanıt vermeyi iyileştirebilen veya edinilen veya indüklenen insülin direncini 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur.

Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 .

Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG'yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç ​​materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .

Protocol

1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması Kültür ortamının hazırlanması Ham'in F-10 ortamını glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL final),% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 2 serum replasmanı ile takviye ederek çoğalma ortamı hazırlayın. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL son) ve% 2 FCS ile takviye ederek farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın. </o…

Representative Results

3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA'ya uygulanmıştır. Hücrele…

Discussion

Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié'yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse'yi (FNS) onaylarlar.

Materials

Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/l glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/l glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6ml PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).

Tags

Glucose UptakeInsulin StimulationHuman Primary MyotubesMuscle MetabolismInsulin SensitivityProliferation MediumDifferentiation Medium2DGCytochalasin BDMSOMuscle Satellite CellsCell Culture
check_url/fr/55743?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image