Medición de la Absorción de Glucosa y Respuesta a la Estimulación de la Insulina en<em> In Vitro</em> Myotubes primario humano cultivado
Summary
En este método, las células musculares primarias humanas se cultivan in vitro para obtener miotubos diferenciados y se miden las tasas de captación de glucosa. Proporcionamos un protocolo detallado para cuantificar las tasas en los estados basales y estimulados con insulina usando [3H] 2-desoxi-D-Glucosa radiomarcada.
Abstract
El músculo esquelético es el mayor depósito de glucosa en mamíferos y contribuye en gran medida a la homeostasis de la glucosa. Evaluación de la sensibilidad a la insulina de las células musculares es de gran importancia para todos los estudios dedicados a explorar el metabolismo de la glucosa muscular y la caracterización de las alteraciones metabólicas. En las células musculares, las proteínas del transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4) se trasladan a la membrana plasmática en respuesta a la insulina, permitiendo así la entrada masiva de glucosa en la célula. La capacidad de las células musculares para responder a la insulina mediante el aumento de la tasa de captación de glucosa es una de las lecturas estándar para cuantificar la sensibilidad de las células musculares a la insulina. Los miotubos primarios humanos son un modelo in vitro adecuado, ya que las células mantienen muchas características del fenotipo del donante, incluyendo la sensibilidad a la insulina. Este modelo in vitro también es adecuado para la prueba de cualquier compuesto que pueda afectar la capacidad de respuesta a la insulina. Las mediciones de la tasa de captación de glucosa en myotubes diferenciados reflejanSensibilidad a la insulina.
En este método, las células musculares primarias humanas se cultivan in vitro para obtener miotubos diferenciados, y se miden las tasas de captación de glucosa con y sin estimulación con insulina. Proporcionamos un protocolo detallado para cuantificar las tasas de transporte de glucosa pasiva y activa usando [3H] 2-desoxi-D-Glucosa radiomarcada ([3H] 2dG). Se proporcionan métodos de cálculo para cuantificar las tasas basales activas y estimuladas con insulina, así como el doble de estimulación.
Introduction
El músculo esquelético es el mayor depósito de glucosa en mamíferos y contribuye en gran medida a la homeostasis de la glucosa. Este tejido sensible a la insulina es el sitio primario de la captación de glucosa que se desencadena por la estimulación de insulina [ 1] .
En la diabetes tipo 2, la resistencia a la insulina se observa en varios tejidos, incluyendo el músculo esquelético, y conduce a una concentración de glucosa sanguínea por encima de lo normal. Por lo tanto, es de gran relevancia determinar el nivel de sensibilidad a la insulina de este tejido y sus células, ya sea que se pretenda caracterizar un defecto en un sujeto, o evaluar la eficacia de un tratamiento con la intención de mejorarlo. En sujetos humanos o animales, la técnica estándar de oro para evaluar la sensibilidad a la insulina es la pinza hiperinsulinémica-euglicémica. Introducido por DeFronzo en 1979 2 y modificado desde 3 , 4 entonces, el método permite cuantificar todo el cuerpo aNd de los tejidos sensibilidad a la insulina medida como la tasa de glucosa a ser perfundida bajo la estimulación de insulina para mantener la concentración normal de glucosa en sangre.
La exploración de la sensibilidad a la insulina también se puede realizar a nivel celular utilizando modelos musculares in vitro , y la medición de las tasas de captación de glucosa sigue siendo una herramienta eficiente y confiable para cuantificar la respuesta biológica de la célula a la estimulación con insulina 5 , 6 , 7 . De hecho, la medición de la captación de glucosa cuantifica la respuesta biológica celular a la estimulación de la insulina, desde la unión de la insulina a su receptor a la translocación de vesículas enriquecidas con GLUT4, e incluyendo la señalización intracelular y fosforilación cascadas [ 8] .
Esto es de gran interés para las muestras humanas, ya que los miotubos diferenciados mantienen muchas características del fenotipo del donante, incluyendo la propiedad metabólicaY trastornos observados en el paciente 9 , 10 , 11 , 12 . Los miotubos muestra similitudes estructurales, metabólicas y fenotípicas con el músculo esquelético 13 , 14 , incluyendo la expresión de los transportadores de glucosa 15 y la maquinaria de señalización de insulina celular 16 . Por lo tanto, la medición de la captación de glucosa en los miotubos primarios es relevante para caracterizar el fenotipo muscular de un donante, o investigar el efecto de una intervención (fármaco, nutrición o actividad física) sobre la sensibilidad a la insulina en la célula muscular.
La medición de la captación de glucosa en los miotubos cultivados también es una herramienta confiable cuando se realizan experimentos que modifican la sensibilidad a la insulina 17 , 18 . El in vitro </Em> es adecuado para la prueba de cualquier compuesto que podría mejorar la respuesta a la insulina, o podría prevenir o revertir la resistencia a la insulina adquirida o inducida 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Aquí describimos un protocolo detallado para cultivar y diferenciar los miotubos humanos y para medir las tasas de captación de glucosa celular. El método es aplicable a cualquier fuente de células precursoras musculares humanas, ya sean procedentes de preparaciones en laboratorio, colaboración o proveedores comercialmente disponibles. Las líneas de células musculares inmortalizadas, como C2C12 y L6, respectivamente de origen de ratón y rata, también se puede utilizar para la medición de la captación de glucosa con este protocolo [ 7] .
Proporcionamos un protocolo detallado para cuantificar las tasas en estados basales e insulin-estimulados usando radiomarcado [ 3 H] 2dG. TEl uso de un análogo de glucosa marcado permite una determinación precisa de la entrada de glucosa con material de partida reducido, una condición común cuando se trabaja con células primarias. La molécula de glucosa modificada es incapaz de entrar en las vías metabólicas y, por tanto, se acumula dentro de la célula, permitiendo una cuantificación fiable a través de la radiactividad celular total. Las condiciones experimentales incluyen el uso de un inhibidor del transporte de la glucosa (citocalasina B), y las mediciones se realizan con y sin insulina. Esta combinación permite la determinación de las tasas de entrada activa de glucosa, así como el cálculo del cambio de pliegue para el índice de respuesta a la insulina. El método se presenta con una dosis de insulina durante un único tiempo de incubación, pero el protocolo puede modificarse fácilmente para la dosis de respuesta o experimentos con el tiempo 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
La captación de glucosa es una medida biológica clave para probar activadores o inhibidores en el cultivo celular y cómo afectan el uso de glucosa, y la capacidad de la célula para responder a la insulina. El método descrito aquí ha demostrado ser rápido y fiable y ha sido ampliamente utilizado en muchos estudios utilizando miotubos primarios de sujetos sanos y / o pacientes afectados metabólicamente 6 , 7 , 10 ,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a Anne Charrié en el servicio de Radiobiología (Hospital Lyon-Sud) y en Fond National Suisse (FNS) por su apoyo financiero.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
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