Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell'insulina in<em> In vitro</em> Myotubes primario umano coltivato
Summary
In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento del glucosio. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi negli stati basali e stimolati da insulina utilizzando il [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose radiomarcato.
Abstract
Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all'omeostasi del glucosio. La valutazione della sensibilità all'insulina delle cellule muscolari è di grande rilevanza per tutti gli studi dedicati all'esplorazione del metabolismo muscolare del glucosio e alla caratterizzazione delle alterazioni metaboliche. Nelle cellule muscolari, le proteine di glucosio trasportatore di tipo 4 (GLUT4) si traslocano alla membrana plasmatica in risposta all'insulina, consentendo così l'immissione massiccia di glucosio nella cellula. La capacità delle cellule muscolari di rispondere all'insulina aumentando il tasso di assorbimento di glucosio è una delle letture standard per quantificare la sensibilità delle cellule muscolari all'insulina. I miotubi primari umani sono un modello in vitro adatto, in quanto le cellule mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, compresa la sensibilità all'insulina. Questo modello in vitro è anche adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero influenzare la reattività dell'insulina. Riflettere le misurazioni della portata di glucosio in miotubi differenziatiSensibilità all'insulina.
In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento di glucosio con e senza stimolazione dell'insulina. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi di trasporto passivi e attivi di glucosio usando [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiolabeled). I metodi di calcolo sono forniti per quantificare i tassi attivi basali e insulino-stimolati, nonché la piega di stimolazione.
Introduction
Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all'omeostasi del glucosio. Questo tessuto sensibile all'insulina è il sito primario dell'assorbimento di glucosio che è innescato dalla stimolazione insulinica 1 .
Nel diabete di tipo 2, la resistenza all'insulina è osservata in diversi tessuti, inclusi i muscoli scheletrici, e conduce alla normale concentrazione di glucosio nel sangue. Pertanto, è di grande importanza determinare il livello di sensibilità all'insulina di questo tessuto e delle sue cellule, se si vuole caratterizzare un difetto di un soggetto o per valutare l'efficacia di un trattamento che intende migliorare. Nei soggetti umani o animali, la tecnica del gold standard per valutare la sensibilità all'insulina è il morsetto iperinsulinemico euglicemico. Introdotto da DeFronzo nel 1979 2 e modificato dal 3 , 4 poi, il metodo permette di quantificare il corpo intero aNd la reattività dell'insulina misurata come il tasso di glucosio da perfezionare sotto la stimolazione dell'insulina per mantenere la concentrazione normale di glucosio nel sangue.
L'esplorazione di sensibilità all'insulina può essere eseguita anche a livello cellulare utilizzando modelli muscolari in vitro e la misurazione dei tassi di assorbimento di glucosio rimane uno strumento efficace e affidabile per quantificare la risposta biologica della cellula alla stimolazione insulinica 5 , 6 , 7 . Infatti, la misurazione dell'assorbimento di glucosio quantifica la risposta biologica cellulare alla stimolazione dell'insulina, dal legame dell'insulina al suo recettore alla traslocazione delle vescicole arricchite GLUT4, e che comprende le cascate intracellulari di segnalazione e di fosforilazione 8 .
Questo è di grande interesse per i campioni umani, in quanto i miotubi differenziati mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, incluso il metabolismoI disturbi osservati nel paziente 9 , 10 , 11 , 12 . I myotubes mostrano somiglianze strutturali, metaboliche e fenotipiche al muscolo scheletrico 13 , 14 , compresa l'espressione dei trasportatori di glucosio 15 e delle macchine di segnalazione di insulina cellulare 16 . Pertanto, la misurazione dell'assorbimento di glucosio nei miotubi primari è rilevante per caratterizzare il fenotipo muscolare di un donatore, o per indagare l'effetto di un intervento (farmaco, nutrizione o attività fisica) sulla sensibilità dell'insulina nella cellula muscolare.
La misurazione dell'assorbimento di glucosio sui miotubi coltivati è anche uno strumento affidabile quando si eseguono esperimenti che modificano la sensibilità all'insulina 17 , 18 . L' in vitro </Em> è adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero migliorare la reattività all'insulina o potrebbero impedire o invertire la resistenza all'insulina acquisita o indotta dalla 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per coltivare e differenziare i miotubi umani e per misurare i tassi di assorbimento di glucosio cellulare. Il metodo è applicabile a qualsiasi sorgente di cellule umane di precursori muscolari, siano essi provenienti da preparazioni in laboratorio, collaborazioni o fornitori disponibili in commercio. Le linee di cellule muscolari immortalizzate, come C2C12 e L6, rispettivamente dall'origine del topo e del ratto, possono anche essere utilizzate per la misurazione dell'assorbimento di glucosio con questo protocollo 7 .
Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi in stati basali e stimolati da insulina usando radiodiffatti [ 3 H] 2dG. TL'uso di un analogo glucosio etichettato consente una accurata determinazione dell'ingresso di glucosio con un materiale di partenza ridotto, una condizione comune quando si lavora con le cellule primarie. La molecola di glucosio modificata non è in grado di entrare nei percorsi metabolici e quindi si accumula all'interno della cellula, consentendo una quantificazione affidabile tramite la radioattività totale della cellula. Le condizioni sperimentali includono l'uso di un inibitore del trasporto di glucosio (citocalasin B) e le misurazioni vengono eseguite con e senza insulina. Questa combinazione permette di determinare le percentuali di ingresso attive del glucosio, nonché il calcolo del cambiamento di piega per l'indice di risposta dell'insulina. Il metodo viene presentato con una dose di insulina durante un solo periodo di incubazione, ma il protocollo può essere facilmente modificato per la risposta alla dose o per gli esperimenti del corso di tempo 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
L'assorbimento di glucosio è una misura biologica chiave per l'attivazione di attivatori o inibitori sulla coltura cellulare e su come influenzano l'uso del glucosio e la capacità della cellula di rispondere all'insulina. Il metodo descritto qui è stato dimostrato rapido e affidabile ed è stato ampiamente utilizzato in molti studi utilizzando miotubi primari da soggetti sani e / o pazienti affetti da metabolismo 6 , 7 , <sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono Anne Charrié presso il servizio Radiobiology (ospedale Lyon-Sud) e il Fond National Suisse (FNS) per il loro sostegno finanziario.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
References
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
- Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
- Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
- Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
- Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
- Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
- Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
- Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
- Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
- Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
- Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
- Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
- Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
- Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
- Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
- Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
- Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
- Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
- Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
- Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
- Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
- Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
- Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
- Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
- Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
- Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
- Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
- Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
- Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
- Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
- Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
- Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).
