低温での水性ガラスの密度の測定
Summary
極低温での水性混合物のミクロン〜ピコリットルの滴のガラス質相密度を測定するためのプロトコルが記載されている。
Abstract
本発明者らは、所望の極低温相を調製するために、水性混合物および急冷を必要とする他の試料のガラス相低温温度密度を決定する方法を実証する。マイクロリットル〜ピコリットルサイズの液滴は、液体窒素 – アルゴン（N 2 -Ar）混合物中に投射することによって冷却される。液滴の極低温相は、X線回折測定と相関する視覚アッセイを用いて評価される。液体N 2 -Ar混合物の密度は、液滴が中立的に浮揚するまでN 2またはArを加えることによって調整される。この混合物の密度、したがって滴の密度は、試験物質およびアルキメデスの原理を用いて決定される。液状低温混合物の上のガスの管理により、液状低温混合物の上に適切な注意を払い、氷結を最小限に抑え、極低温混合物を定期的に混合して密度の層別化および相分離を防止し、50pLほどの液滴の<0.5％容易に決定することができる。水性凍結保護剤混合物の測定は、凍結保護剤作用の洞察を提供し、生物学的凍結保存における熱収縮適合を容易にする定量的データを提供する。
Introduction
それらの様々な段階における水および水性混合物の物理的特性は、基本的な関心事であり、生物学的系のインビボおよびインビトロでの理解にとって重要である。現代の低温生物学および生物学的凍結保存では、凍結保護剤水溶液のガラス質または非晶質相が特に興味深い1,2 。氷結晶の核形成および増殖は、細胞および組織を破壊し、タンパク質の変性および凝集を促進し、溶媒をガラス化する凍結保存プロトコールがますます普及している。生体分子結晶学において、生体分子間のチャネルにおける溶媒の結晶化は結晶格子を破壊し、回折特性を劣化させる。ガラス化は、急速冷却、脱水、およびグリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（PEG）などの凍結保護溶質の添加の組み合わせによって達成される。アルコールおよび塩が挙げられる。
ガラス化は氷の結晶化および成長を制限するが、冷却関連の試料の損傷をすべて排除するものではない。例えば、タンパク質結晶がガラス化状態3に冷却され、ガラス化された精子細胞および卵母細胞の解凍後の生存率が広範に変化する場合、結晶のモザイシシティ（結晶面の配向の尺度）は、通常、10〜 。
1つの損傷メカニズムは、冷却中の溶媒および周囲の物質の差別的な収縮である3,4,5 。結晶、細胞または組織内の平衡溶媒および溶質濃度は温度依存性であり、溶媒+溶質および周囲物質は異なる量で収縮し得る。迅速な冷却は、ガラス化前の溶媒および溶質の再分配を防止することができ、不均一な非平衡応力が試料の損傷の原因となることがあります。
冷却によって誘発される損傷を減少させる合理的なアプローチは、液体およびガラス化した水性混合物の温度依存密度の知識から利益を得ることができる。溶液の重量に対する溶質の重量（w / w）の50％以上の溶質濃度では、ほとんどの水性凍結保護剤混合物を10 K / s以下の適度な冷却速度でガラス化することができ、大きなガラス質試料を用いて密度測定を行い、密度は、窒素のような液体寒剤に懸濁したときの試料の見かけの重量を測定することによって、アルキメデスの原理を用いて決定することができる。しかし、溶質の濃度が低下すると、ガラス化に必要な冷却速度が急速に上昇します。水性グリセリン混合物の冷却速度は、gの溶質の50％重量で10 K / sからmL（w / v） K /秒で25％w / vass = "xref"> 7。熱伝達は境界層に制限されるので、より大きな冷却速度を達成するためには、より小さい試料8が必要となる。
純粋な硝子水と氷の密度の測定は、巨視的な（グラム質量）試料を構築するために極低温冷却表面上に真空中のマイクロメーター直径（フェムトリットル体積）滴を堆積させることによって達成されている。この試料の密度は液体窒素 – アルゴン混合物中でのクライオフロット法により測定した。この場合、試料が中性に浮揚するまで低温液体の密度を調整した。しかし、従来のガラス質相の密度測定における誤差の重要な原因である空隙量を最小限に抑える方法で、多数の小さな液滴から大きなサンプルを生成することは、自明ではありません。水性混合物の場合、エアロゾル化および真空中での堆積中の溶液成分の差別的な蒸発は、堆積した濃度における実質的な不確実性。
私たちは、クライオフロット法に基づいた方法を開発しました。この方法では、個々の液滴を50μLほどの小さなものを使って水性混合物を正確に密度測定することができます。これらの滴は、元の濃度を維持しながら急速に冷却することができ、X線回折測定と相関する単純な視覚アッセイを使用して極低温状態（ガラス化または結晶化）を評価することができます。この方法は、水性および非水性混合物に広く適用可能であり、細胞（ 例えば 、茎および卵）、組織サンプル、および0.8〜1.4g / mlの低温密度を有するタンパク質結晶を含む様々な生物学的サンプルに拡張することができる。 mLであった。
Protocol
Representative Results
Discussion
それにもかかわらず、器具製造ツールおよび機械へのアクセスが制限された学部によって主に開発された本装置および方法は、50pL程度の個々の液滴に対して高精度の密度測定を提供する。ビトリファイド試料を得るのに十分な冷却速度が十分である50％w / w近くの濃度範囲では、密度は以前のバルク試料の測定で得られた密度と一致する。現在の密度を0％濃度（純水）に外挿することは、77K?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、MCB-1330685賞のNSFによって支持された。 DWMは、コーネル大学の分子生物学訓練グラント（NIH T32GM0082567）からの部分的な支持を認めている。
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
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