Kriyojenik Sıcaklıklarda Sulu Camların Yoğunluğunun Ölçülmesi
Summary
Kriyojenik sıcaklıklarda sulu karışımların mikro-piko-litre büyüklüğündeki damlacıklarının camsı faz yoğunluklarını belirlemek için bir protokol tarif edilmiştir.
Abstract
İstenen kriyojenik sıcaklık fazını hazırlamak için sulu karışımların ve hızlı soğutma gerektiren diğer numunelerin camsı faz kriyojenik sıcaklık yoğunluklarının saptanması için bir yöntem gösteriyoruz. Mikro litreden pikolit boyutundaki düşüşler, bir sıvı nitrojen-argon (N2-Ar) karışımı içine projeksiyonla soğutulur. Damlamanın kriyojenik sıcaklık fazı, X-ışını difraksiyon ölçümleri ile korele olan görsel bir test kullanılarak değerlendirilir. Sıvı N2-Ar karışımının yoğunluğu, damla nötr olarak yüzmesine değene kadar N2 veya Ar eklenerek ayarlanır. Bu karışımın yoğunluğu ve dolayısıyla damla, bir test kütlesi ve Arşimet prensibi kullanılarak belirlenir. Damla preparasyonunda uygun önlemle, buzlanma en aza indirgemek için sıvı kriyojen karışımının üstünde gaz yönetimi ve yoğunluk katmanlaşması ve faz ayrımını önlemek için kriyojenik karışımı düzenli olarak karıştırarak yoğunlukları 50 pL kadar küçük damlaların <% 0.5'i doğru olabilirKolayca tespit edilebilir. Sulu kriyoprotektan karışımlarındaki ölçümler, kriyoprotektan hareketi hakkında bilgi verir ve biyolojik kriyoprezervasyonda termal kontraksiyonu eşleştirmeyi kolaylaştırmak için nicel veri sağlar.
Introduction
Su ve sulu karışımların çeşitli evrelerindeki fiziksel özellikleri büyük önem taşımaktadır ve biyolojik sistemlerin de vivo ve in vitro anlaşılmasında önemlidir. Çağdaş kriyobiyoloji ve biyolojik kriyoprezervasyonda, sulu kriyoprotektan karışımlarının vitröz veya amorf fazları, 1 , 2'ye özel ilgi gösterir. Nükleasyon ve buz kristallerinin büyümesi, hücre ve dokuları bozabilir ve protein denatürasyonunu ve toplanmasını destekleyebilir; bu nedenle, çözücüyü vitrifiye eden kriyoprezervasyon protokolleri gittikçe daha popüler hale geldi. Biyomoleküler kristalografide, biyomoleküller arasındaki kanallardaki çözücünün kristalleştirilmesi, kristal kafesleri bozarak kırınım özelliklerini düşürür. Vitrifikasyon, hızlı soğutma, dehidrasyon ve gliserol, etilen glikol, polietilen glikoller (PEG'ler) gibi kriyoprotektif solütlerin eklenmesiyle sağlanır;Alkoller ve tuzlar.
Vitrifikasyon buz kristalleşmesini ve büyümesini sınırlar, ancak soğutma ile ilgili tüm numune hasarını ortadan kaldırmaz. Örneğin, kristal mozaikliği (kristal düzlem yönelimlerinin dağılım ölçütü), protein kristalleri vitrifiye hale getirildiğinde rutin olarak 10'dan 100'e artar ve vitrifiye sperm hücreleri ve oositlerin çözülme sonrası sağkalım oranları değişir .
Bir hasar mekanizması soğutma sırasında çözücünün ve çevredeki maddenin diferansiyel daralmasıdır ( 3 , 4 , 5) . Bir kristal, hücre veya dokudaki denge çözücüsü ve çözünen madde konsantrasyonları sıcaklığa bağlıdır ve çözücü artı çözünen madde ve çevreleyen malzeme farklı miktarlarda küçülebilir. Hızlı soğutma, çözülmeyi önleyebilir ve vitrifikasyondan önce yeniden dağıtılabilir ve diferansiyel kontratları Üzerinde, örnek hasarına neden olan büyük, homojen olmayan dengesizlik streslerine neden olabilir.
Dolayısıyla, soğutmadan kaynaklı hasarın azaltılmasına yönelik akılcı yaklaşımlar, sıvı ve vitrifiye sulu karışımların sıcaklığa bağlı yoğunluklarının bilgisinden yararlanabilir. Çözeltinin ağırlığına göre ağırlıkça% 50'nin üzerinde olan çözünen konsantrasyonlarda (w / w), çoğu sulu kriyoprotektan karışımı 10 K / s veya daha düşük mütevazi soğutma hızlarıyla vitrifiye edilebilir ve büyük vitröz numuneleri 6 kullanarak yoğunluk ölçümleri yapılabilir. Yoğunluk daha sonra azot gibi bir sıvı kriyojen içine asıldığı zaman numunenin görünür ağırlığını ölçerek Archimedes'in prensibi kullanılarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, çözünen madde konsantrasyonu düştükçe, vitrifikasyon için gerekli soğutma hızları hızla artar: Sulu gliserol karışımları için soğutma oranları, g cinsinden çözünmüş haldeki çözeltinin ağırlığının% 50'sinde <10 K / s'den mL'nin (w / v) çözeltinin hacminin> 1000'e yükselir K / s% 25 w / v'deAss = "xref"> 7. Isı transferi sınır katmanıyla sınırlı hale gelir, böylece daha büyük soğutma hızlarına ulaşmak küçük ve küçük numuneler gerektirir 8 .
Saf cam suyu ve buz yoğunluğunun ölçülmesi, bir makroskopik (gram kütlesi) numune oluşturmak üzere kriyojenik olarak soğutulmuş bir yüzeye bir vakumda mikrometre çapında (femtoliter hacim) damlalar bırakılarak elde edilmiştir. Bu numunenin yoğunluğu, sıvı nitrojen-argon karışımı içinde kriyoflotlama ile belirlendi, burada kriyojenik sıvının yoğunluğu, numune nötr olarak yüzen hale gelene kadar ayarlandı 9 . Bununla birlikte, daha önceki vitröz faz yoğunluğu ölçümlerinde önemli bir hata kaynağı olan boşluk hacimlerini en aza indirecek şekilde çok sayıda küçük damladan büyük numuneler üretmek önemsiz değildir. Sulu karışımlar için, aerosol haline getirme ve vakumda biriktirme sırasında çözelti bileşenlerinin diferansiyel buharlaştırılması,Birikmiş konsantrasyonlarda önemli belirsizlikler.
Kriyoflotasyona dayanan ve 50 pL 10 gibi küçük damlalar kullanarak sulu karışımların doğru yoğunluk tayini için bir yöntem geliştirdik. Bu damlalar, orijinal konsantrasyonlarını koruyarak hızla soğutulabilir ve kriyojenik sıcaklık durumu (vitrifiye veya kristal), X-ışını kırınım ölçümleri ile korele olan basit bir görsel analiz kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, sulu ve sulu olmayan karışımlar için geniş çapta uygulanabilir ve hücreler ( örneğin , gövde ve yumurta), doku numuneleri ve düşük sıcaklık yoğunlukları 0.8 ila 1.4 g / cm2 olan protein kristalleri dahil çeşitli biyolojik örneklere kadar uzatılabilir. ml.
Protocol
Representative Results
Discussion
Öncelikle alet yapım araçlarına ve makinelere sınırlı erişimi olan lisans öğrencileri tarafından geliştirilen mevcut cihaz ve yöntemler, 50 pL kadar küçük bireysel sıvı damlaları için son derece hassas yoğunluk ölçümleri sunar. Küçük soğutma hızlarının vitrifiye numuneleri elde etmek için yeterli olduğu konsantrasyon aralığının% 50'den yakınında ve yoğunluğunda, yoğunluklar, toplu numuneler üzerindeki daha önceki ölçümlerde elde edilen konsantrasyonlarla aynıdır. Mevc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NSF tarafından MCB-1330685 ödülü ile desteklenmiştir. DWM, Cornell Üniversitesi Moleküler Biyofizik Eğitimi Grant'ının kısmi desteğini onayladı (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
