Cpf1'i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller
Summary
CRISPR ile ilişkili protein Cpf1, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR RNA (crRNA) yardımıyla, istenilen noktalarda çift sarmallı DNA'yı parçalayıp yapışkan uçlar üretebilir. Bu karakteristiğe dayanarak, bir DNA montaj standardı (C-Brick) oluşturuldu ve kullanımını ayrıntılandıran bir protokol burada açıklandı.
Abstract
CRISPR ile ilişkili protein Cpf1 çift sarmallı DNA'yı CRISPR RNA'nın (crRNA) rehberliğinde parçalayıp yapışkan uçlar üretir. Bu özellikten dolayı Cpf1, C-Brick adı verilen ve uzun tanıma yerleri ve kısa izlerin avantajına sahip bir DNA montaj standardının oluşturulması için kullanılmıştır. Standart bir C-Tuğla vektöründe, dört Cpf1 tanıma bölgesi vardır – ön ek (T1 ve T2 siteleri) ve son ek (T3 ve T4 bölgeleri) – biyolojik DNA parçalarını çevreleyen. T2 ve T3 bölgelerinin bölünmesi tamamlayıcı yapışkan uçlar üretir ve bu da T2 ve T3 bölgeleriyle DNA parçalarının birleştirilmesini sağlar. Bu arada, montajdan sonra parçalar arasında kısa bir "GGATCC" skarı meydana gelir. Yeni oluşturulan plazmid dört kez Cpf1 bölünme yerini bir kez daha içerdiğinden yöntem, DNA parçalarının yinelenen montajını sağlar ve bu da, BioBrick ve BglBrick standartlarına benzer. DNA parçalarını bir araya getirmek için C-Brick standardının kullanımını özetleyen bir prosedürBurada açıklanmaktadır. C-Brick standardı, bilim adamları, lisansüstü öğrenciler ve lisans öğrencileri ve hatta amatörler tarafından yaygın bir şekilde kullanılabilir.
Introduction
DNA biyolojik parçalarının standardizasyonu sentetik biyolojinin gelişimi için önemlidir 1 . Bir DNA montaj prosedürünün geliştirilmesi, geçici test tasarımlarının yerini alabilir ve genetik bileşenlerin daha büyük sistemlere montajı sırasında ortaya çıkan beklenmedik sonuçların çoğunu kaldırabilir. BioBrick standardı (BBF RFC 10), önerilen en erken DNA montaj standartlarından biriydi. Önek dizisini (EcoRI ve Xbal kesim bölgeleri içeren) ve son ekleme dizisini (SpeI ve PstI kesme bölgelerini içeren) 2 , 3 kullanır . XbaI ve SpeI'nin birbirine tamamlayıcı uçları olduğu için, XbaI ve SpeI ile kesilen BioBrick DNA parçaları, tekrar tekrar montaj için yeni bir BioBrick üretecek şekilde birleştirilebilir.
Bazı kusurlar, BioBrick standardı 4 kullanılarak tanımlanmıştır. Örneğin, 8 bp'lik bir skar üretirFüzyon proteinlerinin inşasına izin vermeyen DNA parçaları arasında. Ayrıca, yukarıda sözü edilen dört 6-bp kısıtlama sahası türü DNA parçalardan çıkarılmalıdır; bu çok rahatsız edicidir. İlk problemi çözmek için BglBrick standardı kuruldu 5 . Gly-Ser üreten ve çoklu proteinlerin veya protein alanlarının kaynaşmasına izin veren 6 bp "GGATCT" skarını oluşturur. IBrick, ikinci problemle başa çıkmak için geliştirildi 6 . Uzun DNA sekanslarını tanıyan homojenleştirme endonükleazları (HE) kullanır. HE tanıma siteleri nadiren doğal DNA dizilerinde mevcut olduğundan, iBrick standardı, DNA dizilerini değiştirmeden iBrick parçalarının doğrudan yapımı için kullanılabilir. Bununla birlikte, iBrick standardı DNA parçaları arasında 21 bp'lik bir skar bırakır ve bu da onun hoşnutsuzluğunun nedeni olabilir.
Son yıllarda kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) sistemi hızla gelişti 7 , 8 . CRISPR ile ilişkili (Cas) proteinler arasında, Streptococcus pyogenes'ten Cas9 endonuclease şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır . Çoğunlukla künt uçları olan çift sarmal DNA kopmaları (DSB'ler) getirir 9 .
2015'te Zhang ve arkadaşları, Cpf1'i ( Prevotella ve Francisella 1'den CRISPR) ilk kez karakterize etti . Sınıf 2 tip V CRISPR-Cas sistemine aittir ve bir CRISRP RNA (crRNA) rehberli endonükleaz 10'dur . Cas9'un aksine, Cpf1, 4 veya 5 nt 5 'çıkıntı 10 içeren bir DSB'yi sunar. Bu özelliğe dayanarak Cpf1, bir DNA montaj standardı olan C-Brick 4'ü geliştirmek için kullanıldı. Bir C-Tuğla standart vektöründe, ön ek T1 / T2'nin ve bitişik T3 / T4'ün dört Cpf1 hedef bölgesi biyolojik kısımlara kenetlenir; Bu, BioBrick standardına benzer. T2 ve T3 bölmelerinin bölünmesi pTamamlayıcı yapışkan uçları geliştirir, parçaların arasına bir "GGATCC" yara üretirken DNA bölümlerinin yinelemeli montajını gerçekleştirmek mümkündür. Özellikle, C-Brick standardının iki ana avantajı vardır: uzun hedef sekansları tanımak ve kısa izleri bırakmak. C-Brick tarafından üretilen 6 bp'lik "GGATCC" skar, füzyon proteinlerinin oluşturulmasına izin veren Gly-Seriyi kodlar. Ayrıca, C-Brick standardı da kısmen BglBrick ve BioBrick standartlarıyla uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol DNA montaj standardı C-Brick için bir prosedürü açıklamaktadır. Bu protokolün en önemli adımı, C-Brick standart vektörünün doğrusallaştırılmasıdır; Vektörün tamamlanmamış bölünmesi başarı oranını ciddi şekilde etkileyebilir. Buna ek olarak, Cpf1 esas olarak "18-23" bölünme paterninde hedef DNA sekanslarını parçalasa da, DNA toplanmasından sonra az sayıda mutasyona neden olabilecek iki baz yakınındaki yanlişlı bölünme 4 de tespit ed…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C-Tuğla standardının geliştirilmesi sırasında teknik yardımları için Shanghai Tolo Biotech'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisinin Stratejik Öncelik Araştırma Programından hibelerle desteklenmiştir (Grund No XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. . Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
