Protokoller til C-Brick DNA Standard Assembly ved anvendelse af Cpf1
Summary
CRISPR-associeret protein Cpf1 kan styres af et specielt designet CRISPR-RNA (crRNA) til spaltning af dobbeltstrenget DNA på ønskede steder, der genererer klæbrige ender. Baseret på denne egenskab blev en DNA-samlingsstandard (C-Brick) etableret, og en protokol, der beskriver dens anvendelse, er beskrevet her.
Abstract
CRISPR-associeret protein Cpf1 spalter dobbeltstrenget DNA under vejledning af CRISPR RNA (crRNA), der genererer klæbrige ender. På grund af denne egenskab er Cpf1 blevet anvendt til etablering af en DNA-samlingsstandard kaldet C-Brick, som har fordelen ved lange genkendelsessteder og korte ar. På en standard C-Brick-vektor er der fire Cpf1-genkendelsessteder – præfiks (T1 og T2-steder) og suffikset (T3 og T4-steder) – flankerende biologiske DNA-dele. Klyvningen af T2- og T3-steder producerer komplementære klæbrige ender, hvilket muliggør samling af DNA-dele med T2- og T3-steder. I mellemtiden genereres et kort "GGATCC" ar mellem dele efter samling. Da det nydannede plasmid igen indeholder de fire Cpfl-spaltningssteder, muliggør fremgangsmåden den iterative samling af DNA-dele, hvilket svarer til de af BioBrick og BglBrick-standarder. En procedure, der beskriver brugen af C-Brick-standarden for at samle DNA-deleEr beskrevet her. C-Brick-standarden kan i vid udstrækning anvendes af forskere, kandidater og bachelorstuderende, og endda amatører.
Introduction
Standardiseringen af DNA-biologiske dele er vigtig for udviklingen af syntetisk biologi 1 . Udviklingen af en DNA-samlingsprocedure kan erstatte ad hoc- eksperimentelle designs og fjerne mange af de uventede resultater, der opstår under samlingen af genetiske komponenter i større systemer. BioBrick-standarden (BBF RFC 10) var en af de tidligste foreslåede DNA-monteringsstandarder. Den anvender præfiksekvensen (indeholdende EcoRI- og XbaI-skæresites) og suffiksekvensen (indeholdende SpeI- og PstI-skæresites) 2 , 3 . Fordi XbaI og SpeI har komplementære sammenhængende ender, kan BioBrick DNA-dele, der er skåret med XbaI og SpeI, sammenføjes og generere en ny BioBrick til yderligere iterativ samling.
Nogle defekter er blevet identificeret ved brug af BioBrick standard 4 . For eksempel producerer den en 8-bp arMellem DNA-delene, hvilket ikke tillader konstruktion af in-fusionsproteiner. Desuden skal de fire ovennævnte typer af 6-bp restriktionssteder fjernes fra DNA-delene, hvilket er meget ubelejligt. BglBrick-standarden blev oprettet for at løse det første problem 5 . Det skaber en 6-bp "GGATCT" ar, der producerer Gly-Ser og giver mulighed for fusion af flere proteiner eller protein domæner. IBrick blev udviklet til at håndtere det andet problem 6 . Det bruger homing endonucleases (HEs), som genkender lange DNA-sekvenser. Da HE-genkendelsesstederne sjældent findes i naturlige DNA-sekvenser, kan iBrick-standarden anvendes til direkte konstruktion af iBrick-dele uden at ændre deres DNA-sekvenser. Imidlertid forlader iBrick-standarden en 21 bp ar mellem DNA-delene, hvilket kan være årsagen til dens upopularitet.
I de senere år har de klyngede regelmæssigt adskilt korte palindromiske gentagelser (CRISPR) system har udviklet sig hurtigt 7 , 8 . Blandt de CRISPR-associerede (Cas) proteiner anvendes Cas9 endonuklease fra Streptococcus pyogenes i vid udstrækning . Det introducerer for det meste dobbeltstrengede DNA-pauser (DSB'er) med stumpe ender 9 .
I 2015 karakteriserede Zhang og kollegaer Cpf1 (CRISPR fra Prevotella og Francisella 1) for første gang. Det tilhører klasse 2 type V CRISPR-Cas-systemet og er en CRISRP RNA (crRNA) -guided endonuclease 10 . I modsætning til Cas9 introducerer Cpf1 en DSB med et 4 eller 5 nt 5 'overhæng 10 . Baseret på denne karakteristik blev Cpf1 brugt til at udvikle en DNA-samlingsstandard, C-Brick 4 . På en C-Brick-standardvektor flankerer fire Cpf1-målsteder af præfikset T1 / T2 og suffixet T3 / T4 de biologiske dele; Dette ligner BioBrick-standarden. Som spaltningen af T2 og T3 sites pRoduces komplementære klæbrige ender, er det muligt at udføre den iterative samling af DNA-dele under dannelse af et "GGATCC" ar mellem delene. C-Brick-standarden har især to hovedfordele: At genkende lange målsekvenser og forlade korte ar. Den 6 bp "GGATCC" ar, der er genereret af C-Brick, koder for Gly-Ser, som muliggør konstruktion af fusionsproteiner. Desuden er C-Brick-standarden også delvist kompatibel med BglBrick og BioBrick standarderne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en procedure for DNA-samlingsstandarden C-Brick. Det vigtigste trin i denne protokol er lineariseringen af C-Brick standardvektoren; Ufuldstændig spaltning af vektoren kunne alvorligt påvirke succeshastigheden. Selvom Cpf1 primært spalter mål-DNA-sekvenser i "18-23" spaltningsmønsteret, blev der også detekteret unøjagtig spaltning nær de to baser 4 , hvilket kan forårsage et lille antal mutationer efter DNA-samling. Derfor er Sanger-sekventering n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Shanghai Tolo Biotech for deres tekniske assistance under udviklingen af C-Brick-standarden. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det kinesiske videnskabelige videnskabs videnskabelige prioritetsprogram (stipendium nr. XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. . Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
