Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1
Summary
Das CRISPR-assoziierte Protein Cpf1 kann durch eine speziell entwickelte CRISPR-RNA (crRNA) geführt werden, um doppelsträngige DNA an gewünschten Stellen zu spalten und klebrige Enden zu erzeugen. Basierend auf dieser Eigenschaft wurde ein DNA-Assembler-Standard (C-Brick) etabliert, und ein Protokoll, das seine Verwendung beschreibt, wird hier beschrieben.
Abstract
CRISPR-assoziiertes Protein Cpf1 spaltet doppelsträngige DNA unter der Leitung von CRISPR RNA (crRNA) und erzeugt klebrige Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde Cpf1 für die Etablierung eines DNA-Assembler-Standards namens C-Brick verwendet, der den Vorteil von langen Erkennungsstellen und kurzen Narben hat. Auf einem Standard-C-Brick-Vektor gibt es vier Cpf1-Erkennungsstellen – das Präfix (T1- und T2-Standorte) und das Suffix (T3- und T4-Standorte) – flankierende biologische DNA-Teile. Die Spaltung von T2- und T3-Stellen erzeugt komplementäre klebrige Enden, die die Montage von DNA-Teilen mit T2- und T3-Stellen ermöglichen. Mittlerweile wird eine kurze "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen nach der Montage erzeugt. Da das neu gebildete Plasmid noch einmal die vier Cpf1-Spaltstellen enthält, erlaubt die Methode die iterative Assemblierung von DNA-Teilen, die denjenigen von BioBrick- und BglBrick-Standards ähnlich ist. Ein Verfahren, das die Verwendung des C-Brick-Standards zur Zusammenstellung von DNA-Teilen skizziertWird hier beschrieben. Die C-Brick-Standard kann weit verbreitet von Wissenschaftlern, Absolventen und Studenten und sogar Amateure verwendet werden.
Introduction
Die Standardisierung von DNA-biologischen Teilen ist wichtig für die Entwicklung der synthetischen Biologie 1 . Die Entwicklung eines DNA-Assemblierungsverfahrens kann Ad-hoc- experimentelle Entwürfe ersetzen und viele der unerwarteten Ergebnisse entfernen, die bei der Montage von genetischen Komponenten in größere Systeme entstehen. Der BioBrick Standard (BBF RFC 10) war einer der frühesten vorgeschlagenen DNA Assembly Standards. Es verwendet die Präfixsequenz (die EcoRI- und XbaI-Schneidstellen enthält) und die Suffixsequenz (die SpeI- und PstI-Schneidstellen enthält) 2 , 3 . Da XbaI und SpeI komplementäre zusammenhängende Enden haben, können BioBrick DNA-Teile, die mit XbaI und SpeI geschnitten werden, miteinander verbunden werden und einen neuen BioBrick für eine weitere iterative Montage erzeugen.
Bei der Verwendung des BioBrick-Standards 4 wurden einige Mängel festgestellt. Zum Beispiel produziert es eine 8-bp-NarbeZwischen den DNA-Teilen, die nicht die Konstruktion von In-Fusionsproteinen ermöglicht. Außerdem müssen die vier vorgenannten Typen von 6-bp-Restriktionsstellen aus den DNA-Teilen entfernt werden, was sehr unpraktisch ist. Der BglBrick-Standard wurde eingerichtet, um das erste Problem zu lösen 5 . Es schafft eine 6-bp "GGATCT" Narbe, die Herstellung von Gly-Ser und ermöglicht die Fusion von mehreren Proteinen oder Protein-Domains. IBrick wurde entwickelt, um mit dem zweiten Problem umzugehen 6 . Es verwendet Homing-Endonukleasen (HEs), die lange DNA-Sequenzen erkennen. Da die Erkennungsstandorte selten in natürlichen DNA-Sequenzen existieren, kann der iBrick-Standard für den direkten Aufbau von iBrick-Teilen ohne Modifikation ihrer DNA-Sequenzen verwendet werden. Allerdings verlässt der iBrick-Standard eine 21 bp-Narbe zwischen den DNA-Teilen, was der Grund für seine Unbeliebtheit sein könnte.
In den letzten Jahren gingen die gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Wiederholungen (CRIS) zusammenPR) System hat sich schnell entwickelt 7 , 8 . Unter den CRISPR-assoziierten (Cas) Proteinen ist Cas9 Endonuklease aus Streptococcus pyogenes heute weit verbreitet . Es führt meist doppelsträngige DNA-Pausen (DSBs) mit stumpfen Enden 9 ein .
Im Jahr 2015 charakterisierten Zhang und Mitarbeiter Cpf1 (CRISPR von Prevotella und Francisella 1) zum ersten Mal. Es gehört zum Klasse-2-Typ-V-CRISPR-Cas-System und ist eine CRISRP-RNA (crRNA) -geführte Endonuklease 10 . Im Gegensatz zu Cas9 führt Cpf1 einen DSB mit einem 4 oder 5 nt 5 'Überhang 10 ein . Basierend auf dieser Eigenschaft wurde Cpf1 verwendet, um einen DNA-Assemblystandard C-Brick 4 zu entwickeln. Auf einem C-Brick-Standardvektor flankieren vier Cpf1-Zielstellen von vorangestellten T1 / T2 und suffixed T3 / T4 die biologischen Teile; Dies ähnelt dem BioBrick-Standard. Als Spaltung von T2- und T3-Stellen pFührt zu komplementären klebrigen Enden, es ist möglich, die iterative Anordnung von DNA-Teilen durchzuführen, während eine "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen erzeugt wird. Bemerkenswerterweise hat der C-Brick-Standard zwei Hauptvorteile: Erkennung langer Zielsequenzen und kurzer Narben. Die von C-Brick erzeugte 6 bp "GGATCC" Narbe kodiert Gly-Ser, was den Aufbau von Fusionsproteinen ermöglicht. Darüber hinaus ist der C-Brick-Standard auch teilweise mit den BglBrick- und BioBrick-Standards kompatibel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für den DNA-Assemblierungsstandard C-Brick. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Linearisierung des C-Brick-Standardvektors; Eine unvollständige Spaltung des Vektors könnte die Erfolgsquote ernsthaft beeinträchtigen. Zusätzlich, obwohl Cpf1 hauptsächlich Ziel-DNA-Sequenzen in dem "18-23" -Spaltmuster spaltet, wurde auch eine ungenaue Spaltung nahe den beiden Basen 4 nachgewiesen, was eine kleine Anzahl von Mutationen nach der…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Shanghai Tolo Biotech für ihre technische Unterstützung bei der Entwicklung des C-Brick Standards. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Strategischen Schwerpunktforschungsprogramm der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Grant Nr. XDB19040200) unterstützt.
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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