Protocolli per l'assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1
Summary
La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo.
Abstract
La proteina Cpf1 associata a CRISPR fila il DNA a doppio filamento sotto la guida di CRISPR RNA (crRNA), generando estremità appiccicose. A causa di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per la creazione di un sistema di assemblaggio del DNA chiamato C-Brick, che ha il vantaggio di lunghi siti di riconoscimento e brevi cicatrici. Su un vettore standard C-Brick, ci sono quattro siti di riconoscimento Cpf1 – il prefisso (siti T1 e T2) e il suffisso (siti T3 e T4) – parti del DNA biologico flanking. La scissione dei siti T2 e T3 produce estremità appiccicose complementari, che consentono l'assemblaggio di parti del DNA con i siti T2 e T3. Nel frattempo, una breve cicatrice "GGATCC" viene generata tra le parti dopo l'assemblaggio. Poichè il plasmide appena costituito contiene ancora i quattro siti di scissione di Cpf1, il metodo consente l'assemblaggio iterativo di parti del DNA, che è simile a quello di standard BioBrick e BglBrick. Una procedura che descrive l'utilizzo dello standard C-Brick per assemblare parti del DNAÈ descritto qui. Lo standard C-Brick può essere ampiamente usato da scienziati, laureati e studenti universitari, e anche dilettanti.
Introduction
La standardizzazione delle parti biologiche del DNA è importante per lo sviluppo della biologia sintetica 1 . Lo sviluppo di una procedura di assemblaggio del DNA può sostituire disegni sperimentali ad hoc e rimuovere molti dei risultati imprevisti che si verificano durante l'assemblaggio di componenti genetici in sistemi più grandi. Lo standard BioBrick (BBF RFC 10) è stato uno dei più antichi standard di assemblaggio del DNA proposto. Utilizza la sequenza di prefisso (contenente i siti di taglio EcoRI e XbaI) e la sequenza di suffisso (contenente siti di taglio SpeI e PstI) 2 , 3 . Poiché XbaI e SpeI hanno finiti complementari coesivi, le parti del DNA di BioBrick che vengono tagliate con XbaI e SpeI possono essere unite insieme, generando un nuovo BioBrick per un ulteriore assemblaggio iterativo.
Alcuni difetti sono stati identificati con l'uso dello standard BioBrick 4 . Ad esempio, produce una cicatrice da 8 bpTra le parti del DNA, che non consentono la costruzione di proteine in fusione. Inoltre, i quattro tipi di restrizione a 6 bp di cui sopra devono essere rimossi dalle parti del DNA, che è molto scomodo. Lo standard BglBrick è stato creato per risolvere il primo problema 5 . Crea una cicatrice a 6 bp "GGATCT", che produce Gly-Ser e consente la fusione di più proteine o domini proteici. IBrick è stato sviluppato per affrontare il secondo problema 6 . Utilizza endonucleasi di homing (HEs) che riconoscono lunghe sequenze di DNA. Poiché i siti di riconoscimento HE raramente esistono nelle sequenze di DNA naturali, lo standard iBrick può essere utilizzato per la costruzione diretta di parti iBrick senza modificarne le sequenze di DNA. Tuttavia, lo standard iBrick lascia una cicatrice di 21 bp tra le parti del DNA, che potrebbe essere il motivo della sua impopolarità.
Negli ultimi anni, i cluster regolarmente hanno interspato brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) ha sviluppato rapidamente 7 , 8 . Tra le proteine associate a CRISPR (Cas), l'endonucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes è ora ampiamente utilizzata. Esso presenta per lo più due interruzioni di DNA a doppio filamento (DSB) con estremità lisce 9 .
Nel 2015, Zhang e colleghi hanno caratterizzato per la prima volta Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1). Appartiene al sistema CRISPR-Cas di classe 2 di tipo V ed è un CRISRP RNA (crRNA) -guardato endonucleasi 10 . A differenza di Cas9, Cpf1 introduce un DSB con 4 o 5 nt 5 'overhang 10 . Sulla base di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per sviluppare uno standard di assemblaggio del DNA, C-Brick 4 . Su un vettore standard C-Brick, quattro siti target Cpf1 di prefissati T1 / T2 e suffixed T3 / T4 fianco le parti biologiche; Questo è simile allo standard BioBrick. Come la scissione dei siti T2 e T3 pGenera estremità appiccicose complementari, è possibile eseguire l'assemblaggio iterativo delle parti del DNA, generando una cicatrice "GGATCC" tra le parti. In particolare, lo standard C-Brick ha due vantaggi principali: riconoscere lunghe sequenze di bersagli e lasciare brevi cicatrici. La cicatrice a 6 bp "GGATCC" generata da C-Brick codifica Gly-Ser, che consente la costruzione di proteine di fusione. Inoltre, lo standard C-Brick è parzialmente compatibile con gli standard BglBrick e BioBrick.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive una procedura per lo standard di assemblaggio del DNA C-Brick. Il passo più importante in questo protocollo è la linearizzazione del vettore standard C-Brick; La scissione incompleta del vettore potrebbe influenzare seriamente il tasso di successo. Inoltre, sebbene Cpf1 praticamente abbia sequenze di DNA bersaglio nel pattern di scissione "18-23", è stata rilevata anche una scissione inesatta vicino alle due basi 4 , che possono causare un piccolo numero di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Shanghai Tolo Biotech per la loro assistenza tecnica durante lo sviluppo del C-Brick standard. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca di Priorità Strategica dell'Accademia Cinese delle Scienze (Grant No. XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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