دمج استخراج الصلبة المرحلة المصغرة و لك-مس / مس الكشف عن 3-نيتروتيروسين في البول البشري للتطبيقات السريرية
Summary
تم تطوير طريقة قياس الطيف الكتلي السائل الانتقائي والحساسي جنبا إلى جنب مع استخراج الطور الصلب الفعال على صفيحة ميكروبلات (مسكس) 96-جيدا ميكروبلات (مسكس) لقياس 3-نيتروتيروسين مجانا ( 3-نت) في البول البشري مع الإنتاجية العالية، والتي هي مناسبة للتطبيقات السريرية.
Abstract
مجانا 3-نيتروتيروسين (3-نت) وقد استخدمت على نطاق واسع باعتبارها العلامات البيولوجية المحتملة للإجهاد التأكسدي. وقد تم الإبلاغ عن مستويات متزايدة من 3-نت في مجموعة واسعة من الحالات المرضية. ومع ذلك، الطرق الحالية تفتقر إلى حساسية كافية و / أو خصوصية اللازمة لقياس مستوى الذاتية المنخفضة من 3 نت بشكل موثوق ومرهقة جدا للتطبيقات السريرية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة للتحسين التحليلي بدقة لتحديد مستويات 3-نت والتحقق من دور 3-نت في الظروف المرضية. يعرض هذا البروتوكول تطوير اللوني السائل اللوني جنبا إلى جنب جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (لك-مس / مس) الكشف جنبا إلى جنب مع مصغر استخراج المرحلة الصلبة (سب) لقياس سريع ودقيق من 3-نت في البول البشري كعلامة بيولوجية غير الغازية للإجهاد التأكسدي. سب باستخدام لوحة 96-جيدا تبسيط ملحوظ عملية من خلال الجمع بين تنظيف العينة والتحليل تخصيب دون مشقة مملة وخطوات التبخر، والحد من استهلاك المذيبات، والتخلص من النفايات، وخطر التلوث ووقت المعالجة بشكل عام. توظيف 25 ملم خلات الأمونيوم (نه 4 أوك) في الرقم الهيدروجيني 9 كما الحل شطف سب يعزز إلى حد كبير الانتقائية. وقد تحسنت استجابة إشارة الطيف الكتلي من خلال تعديل التحولات رصد رد فعل متعددة (مرم). استخدام 0.01٪ هكوه كمادة مضافة على عمود بينتافلوروفينيل (بب) (150 مم × 2.1 مم، 3 ميكرون) تحسين استجابة إشارة آخر 2.5 أضعاف وتقصير وقت التشغيل الكلي إلى 7 دقائق. تم تحقيق الحد الأدنى من الكميات (لوق) من 10 بيكوغرام / مل (0.044 نانومتر)، مما يمثل تحسنا كبيرا في الحساسية على المقايسات المبلغ عنها. هذه الطريقة المبسطة والسريعة والانتقائية والحساسة تسمح لوحات اثنين من عينات البول (ن = 192) ليتم معالجتها في فترة 24 ساعة. وبالنظر إلى تحسن ملحوظ في الأداء التحليلي، وأخذ عينات البول غير الغازية وغير مكلفة، والفحص المقترح هو مفيد لمرحلة ما قبل السريرية والسريريةدراسات.
Introduction
وقد دفعت آثار الاكسدة على العرض السريري في طليعة في السنوات الأخيرة 1 . واحدة من المؤشرات الحيوية التي يتم استكشافها هو 3-نيتروتيروسين (3-نت)، وهو منتج مستقر نهاية تشكلت عندما تتفاعل الأنواع النيتروجين التفاعلي (رنز) مع التيروزين، وهو السلائف الناقل العصبي الكاتيكولامين. في حين أن 3-نت قد يكون القيمة السريرية كعلامة بيولوجية ل رنز في الجسم الحي، والتغيرات الكبيرة في خصائص ووظائف التيروزين قد تؤثر سلبا على البروتينات المقابلة والوظائف الخلوية 1 ، 2 . وقد اقترحت الأبحاث الناشئة أن 3-نت قد تلعب دورا هاما في الظروف الالتهابية 3 ، واضطرابات الاعصاب 4 ، 5 ، وأمراض القلب والأوعية الدموية 6 والسكري 7 وكذلك الشروط المتعلقة الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، هذه أوبسوتستند الروائح على نتائج من المنهجيات التي تفتقر إلى الحساسية و / أو الانتقائية 8 و 9 و 10 و 11 . وتتراوح هائلة 3-نت نطاقات تركيز للعينات البيولوجية ذكرت سابقا في الأدب أن المشاكل التحليلية الخطيرة ترتبط مع هذه المقايسات وتحتاج إلى تحسين تقني لتحديد بدقة مستويات 3-نت والتحقق من دورها في أمراض هذه الحالات .
الكميات خالية من 3-نت في المصفوفات البيولوجية يمثل تحديا خاصا للرجل والصك 8 ، 9 ، 10 ، 11 . أولا، فإن مستوى تتبع الذاتية 3-نت يتطلب الكشف فائقة الحساسية. وثانيا، وجود العديد من نظائرها مماثلة هيكليا، وخاصة التيروزين، الذي هو موجود فيالفائض الكبير، يتطلب درجة عالية من الانتقائية. ثالثا، والتشكيل الاصطناعي من 3-نت من قبل نترات التيروزين مع نترات في كل مكان والنيتريت يتطلب اهتماما خاصا أثناء إعداد العينة لتجنب المبالغة في تقدير كاذبة من 3 نت.
من بين مجموعة واسعة من المنهجيات المستخدمة لقياس 3-نت، مس / مس اعتبرت طريقة الذهب القياسية بسبب حساسية متفوقة والانتقائية 11 ، 12 ، 13 ، 14 . اللوني الغاز (غ) إلى جانب مس / مس يقدم أفضل حساسية، ومع ذلك، فإن الخطوات التي لا غنى عنها عينة مشتقة مملة جدا وتستغرق وقتا طويلا لتكون فعالة للفائدة السريرية 15 ، 16 . لك-مس / مس لا يتطلب تعقيد عينة معقدة، مما يجعلها الخيار أكثر واعدة. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات للتغلب على مثل سينزيتيفيتي من لك-مس / مس الأساليب المذكورة في الأدب يحتاج إلى تحسين لقياس وفرة منخفضة 3-نت 7 ، 17 ، 18 ويجب تقصير فترة زمنية طويلة نسبيا لتطبيقات عالية الإنتاجية 12 ، 13 ، 17 ، 19 .
بالإضافة إلى ذلك، عند النظر في التطبيقات السريرية، والمصفوفة البيولوجية المستخدمة تلعب دورا هاما. وينبغي أن يكون من السهل وغير مكلفة للحصول على وغير الغازية إن أمكن 20 ، 21 ، 22 . البلازما، والعينة المستخدمة تقليديا في الأدب، ليست مصفوفة مرغوب فيه سريريا، لذلك تم استخدام منهجية استخدام البول الذي هو غير الغازية وفعالة من حيث التكلفة.
عدة محاولات لتطوير ريلوقد تم إجراء إيبل ومحددة لك-مس / مس المنهجيات باستخدام البول 9 ، 10 ، 11 . ومع ذلك، فقد قصروا جميعا إما أن تكون انتقائية، موثوقة أو فعالة بما فيه الكفاية للاستخدام السريري. وقد تم استجواب فعالية سب الأساسية المهيمنة باستخدام التقليدية خرطوشة المرحلة عكس (نوع C18) كما تنظيف العينة للتحليل 3-نت و سب متسلسل من تبادل الموجبة الكاتيونية قوية (سكس) والمرحلة عكس C18-أوه وقد اقترح 6 ، 7 ، 19 . استخدمت طريقة لك-مس / مس التي تم تطويرها مؤخرا عملية تنقية متعددة الخطوات من C18 سب اليدوي، اللوني عالي الضغط اللوني التحضيري (هبلك)، و سب على الانترنت لتحليل 3-نت 23 . على الرغم من أن هذه الطريقة كانت حساسة بما فيه الكفاية لأغراض سريرية، مع لوق من 0.041 نانومتر، وكانت عملية التنظيف مكثفة ومملة و ريكيالأحمر 3 مل من البول، مما يحد من جدواها لإنتاجية عالية. تم استخدام بوليمر مطبوع جزيئيا كمادة ماصة سب لتحسين كفاءة عملية التنظيف 14 ، ولكن لوق الناتج (0.7 ميكروغرام / مل) لم يكن منخفضا بما يكفي لعينات سريرية. طريقة أخرى المطلوبة ثنائي الأبعاد (2D) لك-مس / مس و اللوني المناعي لتنظيف العينة من أجل تحقيق الحد من الكشف (لود) 0.022 نانومتر 24 . في حين أن كل هذه الأساليب جعلت التقدم في تقييم 3-نت، لم تحقق أي من الحساسية والموثوقية والكفاءة اللازمة للتطبيقات السريرية.
من أجل التحقيق في علم الأمراض مجانا 3-نت ودورها كعلامة بيولوجية للإجهاد التأكسدي في البيئات السريرية، قمنا بتطوير منهجية بسيطة وفعالة ودقيقة ودقيقة، مما يتيح للتطبيقات السريرية عالية الإنتاجية 25 . A المنمنمة المختلطة الموجبة الموجبة كاتيونتم تنفيذ هانج (مسكس) 96-جيدا استخراج ميكروبلات لتحقيق تنظيف عينة بسيطة وفعالة وإثراء 3-نت في استخراج واحد تجاوز العيوب ينظر في الأساليب القائمة التي تتطلب مشتق والتبخر و 2D-لك. اللوني السائل مع 0.01٪ هكوه كمادة مضافة في المرحلة المتنقلة عرضت استجابة إشارة معززة مع دورة الزمن السريع. تم تحسين الانتقائية أيضا من خلال تطبيق معتدل نه 4 أوك شطف حل لشطف انتقائي من 3-نت، واستخدام الانتقال مرم لكلا 3-نت والمعيار الداخلي (إس). تم تعويض تأثير المصفوفة باستخدام كمية مخفضة من إس المفضل النظير 13 C المسمى نظير للتقدير الكمي. مع ظهور هذه المنهجية، والباحثين والأطباء سوف تكون قادرة على التحقق من دور 3-نت في الحالات السريرية ومواصلة استكشاف تأثير الاكسدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاختلافات الكبيرة في تركيزات سبق ذكرها في الأدب عن الحرة الذاتية 3-نت في عينات البول البشرية تكشف عن المشاكل المنهجية المرتبطة المقايسات المتاحة 8 ، 9 ، 10 ، 11 . لا يزال تحديد دقيق للمستوى القاعدي ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وسوف يعترف المؤلفان بسكوت هوارد وأبيغيل ماريناك على الدعم والتنسيق العامين لهذا العمل.
Materials
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
- Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?. J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
- Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer’s disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
- Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
- Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
- Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
- Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
- Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
- Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
- Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
- Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
- Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
- Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
- Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o’-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
- Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
- Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
- Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
- Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
- Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
- . Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html (2011)
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
