臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合
Summary
混合モードカチオン交換（MCX）96ウェルマイクロプレート上での効率的な固相抽出と組み合わせた選択的かつ高感度の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）法を、遊離3-ニトロチロシンの測定のために開発した3-NT）をヒト尿中に高スループットで導入することができ、これは臨床用途に適している。
Abstract
遊離3-ニトロチロシン（3-NT）は、酸化ストレスのための可能なバイオマーカーとして広範に使用されている。広範な病理学的状態において、3-NTのレベルの上昇が報告されている。しかし、既存の方法は、3-NTの低内在レベルを確実に測定するのに必要な十分な感度および/または特異性を欠いており、臨床応用には扱いにくい。したがって、3-NTのレベルを正確に定量化し、病理学的状態における3-NTの役割を確認するためには、分析的改善が急務である。このプロトコルは、非侵襲性バイオマーカーとしてのヒト尿中の3-NTの迅速かつ正確な測定のための小型液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）検出と小型化固相抽出（SPE）酸化ストレス96ウェルプレートを使用するSPEは、退屈な誘導体化および蒸発工程なしでサンプルのクリーンアップおよび分析物の濃縮を組み合わせることによりプロセスを顕著に単純化した廃棄物処分、汚染の危険性および全体的な処理時間を削減する。 SPE溶出溶液としてのpH9での25mM酢酸アンモニウム（NH 4 OAc）の使用は、選択性を実質的に向上させた。質量分析法のシグナル応答は、多重反応モニタリング（MRM）移行の調整によって改善されました。ペンタフルオロフェニル（PFP）カラム（150mm×2.1mm、3μm）上の添加剤として0.01％HCOOHを使用すると、シグナル応答がさらに2.5倍改善され、全実行時間が7分に短縮されました。 10pg / mL（0.044nM）の定量下限（LLOQ）が達成され、報告されたアッセイより有意な感度の改善を示した。この単純化された迅速で選択的で敏感な方法により、尿試料の2つのプレート（n = 192）を24時間の時間内で処理することが可能になる。顕著に改善された分析性能、および非侵襲的かつ安価な尿サンプリングを考慮すると、提案されたアッセイは、前臨床および臨床研究。
Introduction
酸化ストレスが臨床上のプレゼンテーションに及ぼす影響は、近年ますます重要視されています1 。探索されているバイオマーカーの1つは、3-ニトロチロシン（3-NT）であり、反応性窒素種（RNS）がチロシン、カテコールアミン神経伝達物質前駆体と相互作用するときに生成する最終安定生成物である。 3-NTは、in vivoでの RNSのためのバイオマーカーとして臨床的価値を有していてもよいが、チロシンの性質及び機能の実質的な変化が悪影響を対応するタンパク質及び細胞機能1,2に影響を及ぼし得ます。新興の研究では、3-NTは、炎症状態で3、神経変性疾患の重要な役割を果たしていることを示唆している4、5、6心血管疾患や糖尿病7と同様に酸化ストレスに関連する状態。しかし、これらのobservations、感度及び/又は選択8、9、10、11に欠ける方法からの結果に基づいています。以前に文献に報告された生物学的サンプルの3-NTの濃度範囲の大部分は、深刻な分析上の問題がこれらのアッセイに関連していることを示しており、3-NTレベルを正確に定量化し、 。
生物学的マトリックス中の自由3-NTの定量化は、人間と機器8、9、10、11に特別な挑戦を提示しています。第1に、内因性3-NTのトレースレベルは、超高感度検出を必要とする。第二に、多数の構造的に類似した類似体、特にチロシンが存在し、これは非常に過剰であり、高度の選択性を必要とする。第3に、遍在する硝酸塩および亜硝酸塩によるチロシンニトロ化による3-NTの人工的形成は、3-NTの誤った過大評価を避けるために試料調製中に特別な配慮を必要とする。
3-NTを測定するために用いられる方法の多種多様な中でも、MS / MSは、その優れた感度と選択性11、12、13、14に金標準的な方法を考えてきました。ガスクロマトグラフィー（GC）は、MS / MSは、最良の感度を提供結合、しかし、必須サンプル誘導体化ステップは、臨床的有用性15、16のために効率的であることがあまりにも面倒で時間がかかります。 LC-MS / MSは複雑なサンプルの誘導体化を必要とせず、より有望な選択肢になります。それにもかかわらず、克服すべきいくつかの障害があります文献に報告されたLC-MS / MS法のnsitivity低豊富3-NT 7、17、18の測定のために改善する必要があり、比較的長いターンアラウンドタイムは、ハイスループットアプリケーション12のために短くする必要があり、13、17、19 。
さらに、臨床応用を考慮するとき、使用される生物学的マトリックスは重要な役割を果たす。それは簡単で得ることが安価で可能な20、21、22であれば、非侵襲性であるべきです。文献で伝統的に使用されている血漿である血漿は、臨床的に望ましいマトリックスではないので、非侵襲的かつ費用対効果の高い尿を利用する方法論が求められていた。
relを開発するためのいくつかの試みiableと特定LC-MS / MS方法論は、尿9、10、11を用いて行われてきました。しかし、それらはすべて、臨床的使用のために十分に選択的、信頼できる、または効率的であるのに足りない。 3-NTの分析のためのサンプルクリーンアップが疑問視されていると強カチオン交換（SCX）と逆相C18-OHの順次SPE 6提案されているような従来の逆相カートリッジ（C18型）を用いて、優勢なSPEの有効性、 7、19。最近開発されたLC-MS / MS法は、手動C18 SPE、分取高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、および3-NT 23の分析のためのオンラインSPEの多段階精製プロセスを利用した。この方法は、0.041nMのLLOQを有する臨床目的のために十分に敏感であったが、クリーンアッププロセスは集中的で面倒であり、赤色の3 mLの尿。高スループットの実現可能性が制限されています。クリーンアッププロセス14の効率を改善するために、分子的にインプリントされたポリマーをSPE吸着剤として使用したが、得られたLLOQ（0.7μg/ mL）は臨床検体にとって十分に低いものではなかった。別の方法は、0.022 nMで24の検出限界（LOD）を達成するために、2次元（2D）LC-MS / MSおよびサンプルクリーンアップのためのイムノアフィニティークロマトグラフィーを必要としました。これらの方法はすべて3-NTの評価において進歩を遂げてきましたが、臨床応用に必要な感度、信頼性、効率を達成したものはありませんでした。
3-NTの病態とその臨床的環境における酸化ストレスのバイオマーカーとしての役割を調べるために、我々はハイスループットの臨床応用が可能なシンプルで効率的で正確で正確な方法論を開発した25 。小型化された混合モードカチオンexc誘導体化、蒸発および2D-LCを必要とする既存の方法に見られる欠点を迂回して、単一の抽出で3-NTの簡便で効果的なサンプルクリーンアップおよび濃縮を達成するためにハンゲイ（MCX）96ウェル抽出マイクロプレートを実施した。移動相における添加剤として0.01％HCOOHを用いた液体クロマトグラフィーは、迅速なサイクル時間で増強されたシグナル応答を提供した。選択性は、3-NTの選択的溶出のための軽度のNH 4 OAc溶出溶液の適用、および3-NTおよび内部標準（IS）の両方のMRM転移の使用によってさらに改善された。マトリックス効果は、定量化のために好ましい量の13 C標識同位体ISを使用することによって補償された。この方法論の出現により、研究者および臨床医は、臨床状態における3-NTの役割を検証し、さらに酸化ストレスの影響を探ることができるようになる。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前にヒトの尿サンプル中の内因性遊離3-NTについての文献に報告された濃度の実質的なバリエーションが利用可能なアッセイ8、9、10、11に関連した方法論の問題点を明らかにする。ヒト尿中の3-NTの低い基底レベルの正確な決定は、試料調製およびLC-MS / MS分析のための特別な予防措置を必要とす?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Scott HaardとAbigail Marinackがこの作業の全般的なサポートと調整について認めてくれるだろう。
Materials
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
- Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?. J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
- Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer’s disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
- Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
- Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
- Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
- Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
- Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
- Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
- Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
- Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
- Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
- Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
- Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o’-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
- Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
- Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
- Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
- Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
- Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
- . Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html (2011)
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
