Анализ макрофагов Microglia и Monocyte из центральной нервной системы методом проточной цитометрии
Summary
Этот протокол обеспечивает анализ субпопуляций макрофагов в центральной нервной системе взрослого человека с помощью проточной цитометрии и полезен для изучения множественных маркеров, экспрессируемых этими клетками.
Abstract
Многочисленные исследования продемонстрировали роль иммунных клеток, в частности макрофагов, в патологиях центральной нервной системы (ЦНС). В ЦНС имеются две основные популяции макрофагов: (i) микроглия, которые являются резидентными макрофагами ЦНС и получены из предшественников желточного мешка во время эмбриогенеза, и (ii) макрофаги, полученные из моноцитов (MDM), которые могут проникать ЦНС во время болезни и происходят от предшественников костного мозга. Роли каждой субпопуляции макрофагов различаются в зависимости от исследуемой патологии. Кроме того, нет консенсуса относительно гистологических маркеров или отличительных критериев, используемых для этих субпопуляций макрофагов. Однако анализ профилей экспрессии маркеров CD11b и CD45 методом проточной цитометрии позволяет отличить микроглию (CD11b + CD45 med ) от MDM (CD11b + CD45 high ). В этом протоколе показано, что центрифугирование градиента плотностиИ анализ проточной цитометрии может быть использован для характеристики этих субпопуляций макрофагов ЦНС и изучения нескольких интересующих маркеров, выраженных этими клетками, как мы недавно опубликовали. Таким образом, этот метод может способствовать нашему пониманию роли макрофагов в мышиных моделях неврологических заболеваний и может также использоваться для оценки воздействия лекарств на эти клетки.
Introduction
Микроглия представляют собой паренхиматозные резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС). Они играют две ключевые функциональные роли: иммунную защиту и поддержание гомеостаза ЦНС. В отличие от MDM, которые постоянно обновляются из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, микроглиальные клетки дифференцируются от примитивных гемопоэтических клеток-предшественников, происходящих из желточного мешка (YS), которые колонизировали мозг во время эмбрионального развития 1 , 2 , 3 . У грызунов фактор транскрипции Myb играет решающую роль в развитии всех моноцитов и макрофагов, полученных из костного мозга, но для микроглии, полученной из YS, этот фактор невозможен и дифференциация остается зависимой от фактора транскрипции PU.1 4 .
В здоровой ЦНС микроглия являются динамическими клетками, которые постоянно пробовали окружающую среду, scaNning и съемки для инвазионных патогенов или повреждения тканей 5 . Обнаружение таких сигналов инициирует путь к разрешению травмы. Микроглия быстро переключается с разветвленной морфологии на амебоидную, за которой следуют фагоцитоз и высвобождение различных медиаторов, таких как про-или противовоспалительные цитокины. Таким образом, в зависимости от их микроокружения активированная микроглия может приобретать спектр различных состояний прайминга.
Микроглии глубоко влияют на развитие и прогрессирование многих неврологических расстройств. Показано, что в моделях грызунов болезни Альцгеймера (AD) 7 , амиотрофическом боковом склерозе (АЛС) 8 , рассеянном склерозе (РС) 9 или болезни Паркинсона (ПД) 10 микроглия играет двойную роль, либо индуцируя пагубную нейротоксичность, либо действуя В нейропротекторном режиме, который зависит отN конкретное заболевание, стадию заболевания и зависит ли заболевание от системного иммунного отделения 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Большинство поражений ЦНС, наблюдаемых при перечисленных выше заболеваниях, содержат гетерогенную популяцию миелоидных клеток, включая не только паренхиматозную микроглию, но также периваскулярные и менингиальные макрофаги, а также ЦНС, проникающие в МДМ. Эти типы клеток могут дифференциально вносить свой вклад в патофизиологические механизмы, связанные с травмой и восстановлением 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Нынешняя задача исследователей, изучающих эти модели болезней, заключается в том, чтобы установить, проникают ли периферические моноциты и макрофаги в ЦНС, и если да,Пахать резидентную микроглию из этих клеток. Действительно, микроглиальные клетки очень пластичны; Когда они активируются, микроглии повторно выражают маркеры, которые обычно экспрессируются периферическими моноцитами и макрофагами. Поэтому проблема связана с идентификационными маркерами, которые могут отличать резидентную микроглию от инфильтрирующих моноцитов и макрофагов.
Различение этих популяций на срезах мозга с помощью иммуногистологических применений ограничено из-за отсутствия специфических антител. Однако проточный цитометрический анализ является эффективным методом оценки экспрессии нескольких маркеров и различения клеточных популяций (например, лимфоцитов, макрофагов / MDM CD11b + CD45 и микроглии CD11b + CD45 med ), а также субпопуляций клеток 16 , 17 , 18 . В этом протоколе описаны процедуры выделенияМононуклеарных клеток из ЦНС у мышей в моделях неврологических заболеваний с использованием оптимизированной диссиации ферментативной ткани и центрифугирования градиента плотности; А также способ дифференциации популяций микроглии и МДМ в ЦНС с использованием проточной цитометрии.
Другой подход заключается в том, чтобы устранить миелин и очистить клетки с помощью магнитных гранул, конъюгированных с конкретными антителами 19 , 20 , 21 . Удаление миелина с использованием антимиелиновых магнитных шариков является более дорогостоящим и влияет на жизнеспособность и выход изолированных клеток 22 . Эта стадия и следующее иммуномагнитное разделение микроглии ограничивают дальнейшие исследования конкретных популяций иммунных клеток 21 , 22 .
Эти процедуры обеспечивают простой способ изучения субпопуляций макрофагов при развитии болезней иДля определения эффектов лекарственного средства или модификаций генов на фенотипах макрофагов и состояниях активации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Было продемонстрировано, что микроглия и МДМ имеют различные функции и фенотипы в ЦНС, и поэтому идентификация и анализ этих субпопуляций макрофагов необходимы для лучшего понимания неврологических заболеваний 9 , 18 , 25 . Анализ проточ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Ассоциации France Alzheimer и Bpifrance. Наша лаборатория также поддерживается Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie и программой «Investissements d'avenir» ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Мы хотели бы поблагодарить помощь основного объекта культуры CELIS.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
