Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri
Summary
Denne protokol tilvejebringer en analyse af makrofag subpopulationerne i det voksne mus-centralnervesystem ved hjælp af flowcytometri og er nyttig til undersøgelsen af flere markører udtrykt af disse celler.
Abstract
Talrige undersøgelser har vist rollen som immunceller, især makrofager, i sygdomme i centralnervesystemet (CNS). Der er to hovedmakrofagpopulationer i CNS: (i) microgliaen, som er de residente makrofager i CNS og er afledt af æggeblomme-progenitorer under embryogenese, og (ii) de monocyt-afledte makrofager (MDM), som kan infiltrere CNS under sygdom og er afledt af knoglemarvsprogere. Rollerne i hver makrofag subpopulation varierer afhængigt af den patologi, der undersøges. Desuden er der ingen konsensus om de histologiske markører eller de kendetegnende kriterier, der anvendes til disse makrofag subpopulationer. Analysen af ekspressionsprofilerne af CD11b- og CD45-markørerne ved hjælp af flowcytometri tillader os imidlertid at skelne microglia (CD11b + CD45 med ) fra MDM (CD11b + CD45 høj ). I denne protokol viser vi, at densitetsgradientcentrifugeringenOg flowcytometrianalysen kan anvendes til at karakterisere disse CNS-makrofag-subpopulationer og at studere flere markører af interesse udtrykt af disse celler, som vi for nylig offentliggjorde. Således kan denne teknik fremme vores forståelse af makrofagens rolle i musemodeller af neurologiske sygdomme og kan også bruges til at evaluere lægemiddelvirkninger på disse celler.
Introduction
Mikroglia er de parenkymvæv-residente makrofager i centralnervesystemet (CNS). De spiller to vigtige funktionelle roller: immunforsvar og vedligeholdelse af CNS homeostasen. I modsætning til MDM, der fornyes kontinuerligt fra de hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven, adskiller mikrogialcellerne sig fra primitive hæmatopoietiske stamceller, der stammer fra æggeblommehalsen (YS), der koloniserede hjernen under embryonisk udvikling 1 , 2 , 3 . I gnavere spiller transkriptionsfaktoren Myb en afgørende rolle i udviklingen af alle knoglemarv-afledte monocytter og makrofager, men for YS-afledt microglia er denne faktor dispensabel, og differentiering forbliver afhængig af transkriptionsfaktoren PU.14.
I det sunde CNS er microglia dynamiske celler, der konstant prøver deres miljø, scaNning og opmåling til invaderende patogener eller vævsskade 5 . Påvisningen af sådanne signaler initierer en vej for at løse skaden. Mikrogliaen skifter hurtigt fra en forgrenet morfologi til en amoeboid, som efterfølges af fagocytose og frigivelse af forskellige mediatorer, såsom pro- eller antiinflammatoriske cytokiner. Afhængigt af deres mikro-miljø kan således aktiveret microglia erhverve et spektrum af forskellige primertilstande 6 .
Mikroglia påvirker dybt udviklingen og udviklingen af mange neurologiske lidelser. I gnavermodellerne af Alzheimers sygdom (AD) 7 , Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) 8 , Multiple Sclerose (MS) 9 eller Parkinsons sygdom (PD) 10 , er microgliane vist at spille en dobbelt rolle, hvilket enten inducerer skadelig neurotoksicitet eller handler På en neuroprotektiv måde, som er afhængig oN den specifikke sygdom, sygdomsfasen og om sygdommen var påvirket af det systemiske immunrum 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De fleste af de CNS-læsioner, der observeres i ovennævnte sygdomme, indeholder en heterogen population af myeloidceller, herunder ikke kun parenkymisk mikroglia, men også perivaskulære og meningeal-makrofager såvel som CNS-infiltrerende MDM. Disse celletyper kan differentielt bidrage til de patofysiologiske mekanismer relateret til skade og reparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Den nuværende udfordring for forskere, der studerer disse sygdomsmodeller, er at fastslå om de perifere monocytter og makrofager infiltrerer CNS og i så fald at distancereIndusish den residente microglia fra disse celler. Faktisk er mikrogialcellerne meget plastiske; Når de aktiveres, gentager microglia markørerne, der normalt udtrykkes af perifere monocytter og makrofager. Spørgsmålet er derfor baseret på at identificere markører, der kan skelne den residente mikroglia fra de infiltrerende monocytter og makrofager.
Diskrimineringen af disse populationer på hjerneskiver ved immunohistologiske anvendelser er begrænset på grund af manglen på specifikke antistoffer. Flowcytometrianalyse er imidlertid en effektiv teknik til at vurdere ekspressionen af adskillige markører og at skelne cellepopulationer (for eksempel lymfocytter, makrofager / MDM CD11b + CD45 høj og microglia CD11b + CD45 med ) såvel som cellepopulationer 16 , 17 , 18 . Denne protokol beskriver procedurerne for isolering afMononukleære celler fra muse-CNS i neurologiske sygdomsmodeller ved anvendelse af en optimeret enzymatisk vævsdissociation og en densitetsgradientcentrifugering; Såvel som en metode til differentiering af mikroglia- og MDM-populationerne i CNS ved anvendelse af flowcytometri.
En anden fremgangsmåde er at eliminere myelin og rense cellerne ved anvendelse af magnetiske perler konjugeret til specifikke antistoffer 19 , 20 , 21 . Myelinfjernelse ved anvendelse af anti-myelinmagnetiske perler er dyrere og påvirker levedygtigheden og udbyttet af isolerede celler 22 . Dette trin og den følgende immunomagnetiske adskillelse af microglia begrænser yderligere undersøgelser af specifikke immuncellepopulationer 21 , 22 .
Disse procedurer giver en nem måde at studere makrofag subpopulations på i sygdomsudvikling, ogAt bestemme lægemiddelvirkningerne eller genmodifikationerne på makrofagfænotyper og aktiveringstilstande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har vist sig, at microglia og MDM har forskellige funktioner og fænotyper i CNS, og identifikation og analyse af disse makrofag subpopulationer er derfor essentielle for bedre at forstå neurologiske sygdomme 9 , 18 , 25 . Flowcytometrianalyse ved anvendelse af to markører (CD11b og CD45) muliggør sondringen mellem hver subpopulation ( figur 3C ). Denne strategi blev tidligere valideret ved …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Agence National pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer og Bpifrance. Vores laboratorium støttes også af Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie og programmet "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vi vil gerne takke hjælpen fra CELIS cellekultur kernen facilitet.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
