लाखों लोगों को रेटिनल डिगेरेटिव बीमारियों से पीड़ित होता है जिनके कारण अपरिवर्तनीय अंधापन होता है। इनमें से कई रोगों का एक आम तत्व रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (आरजीसी) की हानि है। यह विस्तृत प्रोटोकॉल प्रवाह कोशिकामितीय के साथ सकारात्मक और नकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिक मुरुइन आरजीसी के अलगाव का वर्णन करता है।
न्यूरोडेगनेरेटिव रोगों का अक्सर प्रभावित लोगों पर एक विनाशकारी प्रभाव पड़ता है। रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिका (आरजीसी) हानि सामान्य वृद्धावस्था के अतिरिक्त मधुमेह के रेटिनोपैथी और ग्लूकोमा सहित कई बीमारियों में फैल जाती है। उनके महत्व के बावजूद, आरजीसी को अब तक अध्ययन करना बेहद मुश्किल रहा है क्योंकि इस तथ्य के भाग में यह तथ्य है कि रेटिना में वे विभिन्न प्रकार के कोशिकाओं का केवल एक छोटा प्रतिशत शामिल हैं। इसके अलावा, वर्तमान अलगाव पद्धतियों ने आरजीसी की पहचान करने के लिए इंटरासेल्युलर मार्कर का उपयोग किया है, जो गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। इन तकनीकों में लंबा अलगाव प्रोटोकॉल भी शामिल है, इसलिए आरजीसी प्राप्त करने और अलग करने के लिए व्यावहारिक, मानकीकृत और भरोसेमंद तरीकों की कमी है। यह काम सकारात्मक और नकारात्मक चयन मानदंड दोनों के आधार पर एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहों की रेटिना से प्राथमिक आरजीसी को अलग करने के लिए एक कुशल, व्यापक, और विश्वसनीय पद्धति का वर्णन करता है। प्रस्तुत तरीकों ने आरजीसी के भविष्य के अध्ययन के लिए, बड़ी समझ को बेहतर ढंग से समझने का लक्ष्य दियादृश्य तीक्ष्णता में गिरावट जो न्यूरोडेनेरेटिव रोगों में कार्यात्मक आरजीसी की हानि से उत्पन्न होती है।
आरजीसीएं नतीजतन विभेदित न्यूरॉन्स हैं, और इसलिए, प्रयोग के लिए प्राथमिक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। प्राइमरी मूरीन रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (आरजीसी) के अलगाव और संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास, आरजीसी स्वास्थ्य के तंत्रों और इन विट्रो में अधूरेपन को प्रकट करने के लिए मौलिक है। यह अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो आरजीसी कार्य को बढ़ावा देने और उनकी मृत्यु को कम करने के लिए संभावित उपचार तैयार करना चाहते हैं। आरजीसी के अध: पतन रेटल डिजनजनेटिव बीमारियों से जुड़ा है, जैसे कि ग्लूकोमा, मधुमेह रेटिनोपैथी, और सामान्य उम्र बढ़ने। हालांकि आरजीसी हानि के अधीन विशिष्ट सेलुलर तंत्र स्पष्ट नहीं हैं, जोखिम कारकों की एक श्रृंखला की पहचान की गई है। ऑप्टिक तंत्रिका सिर 1 , 2 , 3 में ऑक्सीजन के अभाव में आरजीसी की मौत 4 का कारण बनता है और उत्तेजना के सक्रियण के बीच होमियोस्टेसिस की परेशानियों के रूप में कार्य करता है और मैंव्यक्तिगत आरजीसी 5 , 6 के भीतर नश्वर रिसेप्टर चुनौतियों की एक श्रृंखला गहन अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं के उपयोग की दिशा में प्रगति बाधित है। सबसे पहले, एक मुरिन रेटिना में उपस्थित आरजीसी की संख्या छोटी है। आरजीसी कुल 7 % , 8 , 9 के कुल रेटिनल कोशिकाओं के 1% से कम के लिए खाता है। दूसरा, अधिकांश आरजीसी-विशिष्ट मार्कर इंट्रासेल्युलर प्रोटीन 10 , 11 , 12 हैं । इन मार्करों के आधार पर चयन ने कोशिकाओं को गैर-व्यवहार्य छोड़ दिया है, जो डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण को रोकता है। अंत में, वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल लंबा और मानकीकरण 13 , 14 की कमी है प्रारंभिक आरजीसी अलगाव प्रोटोकॉल इम्युनोपेनिंग विधियों पर आधारित थे। बैरस एट अल 15 क्लासिक इम्यूनॉप अनुकूलितएनिंग तकनीक और एक दूसरे चरण में जोड़ा गया, जिसमें रक्ताल्पता कोशिकाओं के थोक से मोनोसाइट्स और एन्डोथेलियल कोशिकाओं को शामिल किया गया था जो कि थिओमोसाइट एंटीजेन (उर्फ थेय 1), एक सेल-सतह मार्कर के लिए immunopositivity के आधार पर सकारात्मक चयन से पहले होता है। साल बाद, हांग एट अल उच्च शुद्धता के साथ आरजीसी को अलग करने के लिए सेल सॉर्टिंग रणनीतियों के साथ संयुक्त चुंबकीय मनका अलगाव तकनीक कई वैज्ञानिक अनुप्रयोगों में चुंबकीय मोती का उपयोग अभी भी किया जाता है। एक साथ, चुंबकीय मोती और प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल पृथक कोशिकाओं की शुद्धता में सुधार। हालांकि, इन शुद्धि प्रणालियां अब तक अलग-अलग रिक्तियां से मुरिन आरजीसी के अलगाव के लिए मानकीकृत नहीं हुई हैं।
प्रवाह cytometry एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक तरीका है जो सेल निलंबन की ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति विशेषताओं को मापता है। कोशिकाओं का मात्रात्मक और गुणात्मक दोनों स्तरों पर संवेदनशीलता का विश्लेषण किया जाता है, जिससे सेल लोकल के बहु-आयामी विश्लेषण प्रदान किया जा सकता है।समझना। सेलुलर भेदभाव दो मुख्य भौतिक गुणों पर आधारित होता है: सेल आकार या सतह क्षेत्र और ग्रैन्यूलिटी या आंतरिक जटिलता 17 । एक बहु-आयामी विश्लेषण फ्लोरोरेम्रोम्स के साथ टैग एंटीबॉडी को जोड़कर किया जा सकता है जो समान उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और अलग-अलग उत्सर्जन करता है। प्रवाह cytometry तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और संवेदनशील है। Multitpe लेसरों प्रवाह cytometry द्वारा एकल कोशिकाओं के भी अधिक से अधिक बहु आयामी विश्लेषण की अनुमति इस प्रकार, यह कोशिकीय नमूने के अध्ययन के लिए एक आकर्षक पद्धति है प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलग-अलग कोशिकाओं में विशिष्ट उप-जननुपातों को क्रमबद्ध करने के लिए फ्लो साइटमैट्री द्वारा पहचाना गया बहु-आयामी फ़िनोटीपिक अंतर का उपयोग करता है।
पिछले दशक में, न्यूरॉन्स सहित कई कोशिकाओं के चयन के लिए कई सतह और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन को संभावित बायोमार्कर के रूप में पहचान किया गया है। प्रारंभिक अध्ययन जो चूहों से आरजीसी को अलग करने की मांग करते थे Thy1 एक नाड़ीग्रन्थि सेल के रूप में इस्तेमाल करते थेएल मार्कर दुर्भाग्य से, Thy1, उर्फ सीडी 90 में, अन्य कृंतक प्रजातियों 18 , 1 9 , 20 में एकाधिक ईसोफर्म है और कई रेटिना सेल प्रकार 1 9 , 20 द्वारा व्यक्त की गई है, जिससे यह आरजीसी के लिए एक गैर-विशिष्ट मार्कर बना रहा है। एक अन्य सतह मार्कर, सीडी 48, रेटिना में मोनोसाइटेटिक आबादी पर पाया जाता है, जिसमें मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया शामिल हैं। इन दो सतह के मार्करों का उपयोग करके, एक संशोधित आरजीसी हस्ताक्षर-Thy1 + और CD48 neg कोशिकाएं-विकसित की गईं 15 , 16 , 21 , 22 । दुर्भाग्य से, इन दो चयन मानदंडों को अत्यधिक समृद्ध आरजीसी आबादी के लिए चुनने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। इस अपरिवर्तनीय आवश्यकता को पूरा करने के लिए, एक प्रवाह साइटोमैट्री प्रोटोकॉल विकसित किया गया था 23 बहु-स्तरित सकारात्मक और नकारात्मक चयन मानदंडों के आधार परप्राथमिक मूरिन आरजीसी को समृद्ध और शुद्ध करने के लिए ज्ञात सेल सतह मार्कर
एफएसीएस सेल आबादी शुद्ध करने की पसंद की तकनीक है। अन्य अलगाव विधियों में इम्युनोपेनिंग, चुंबकीय मोती और पूरक निर्धारण की कमी शामिल है। इन अन्य तरीकों पर एफएसीएस का लाभ सेल-सतह मार्करों की एक साथ पहचान …
The authors have nothing to disclose.
लेखकों तकनीकी वीडियो सहायता के लिए माइक्रोबायोलॉजी, इम्यूनोलॉजी और बायोकैमिस्ट्री विभाग के वरिष्ठ इलस्ट्रेटर श्री टिम हिगिंस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; डा। मैथ्यू डब्लू। विल्सन चर्चाओं और उनके सहयोगी टिप्पणियों के लिए जब्लोंस्की और मोरालेस-तिरडो प्रयोगशालाओं के सदस्यों के लिए। यह काम एल्कोन रिसर्च इंस्टिट्यूट युवा जांचकर्ता पुरस्कार (वीएमएम-टी), टेनेसी रिसर्च फाउंडेशन विश्वविद्यालय (वीएमएम-टी), नेशनल आई इंस्टीट्यूट ईवाय 02200 (एमएमजे), गारविन फैलोशिप (वीएमएम-टी) द्वारा समर्थित था; गर्विन प्री-डॉक्टरेट फेलोशिप (जेडकेजी), डिफेंस आर्मी मेडिकल रिसर्च और मैटेरियल कमान (वीएमएम-टी), और अनियंत्रित अनुदान से रिसर्च टू द ब्लिंडनेस।
Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
Pestles | MidSci | PEST | sterile |
Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |