Isolering av primära murin retinala Ganglion-celler (RGC) genom flödescytometri
Summary
Miljoner människor lider av retinal degenerativa sjukdomar som leder till irreversibel blindhet. Ett vanligt element i många av dessa sjukdomar är förlusten av retinala ganglionceller (RGC). Detta detaljerade protokoll beskriver isoleringen av primära murin RGC genom positivt och negativt urval med flödescytometri.
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar har ofta en förödande inverkan på de drabbade. Retinal ganglioncell (RGC) förlust är implicerad i en rad sjukdomar, inklusive diabetisk retinopati och glaukom, förutom normal åldrande. Trots deras betydelse har RGCs varit extremt svåra att studera hittills, delvis beroende på att de bara omfattar en liten andel av det stora antalet celler i näthinnan. Dessutom använder nuvarande isoleringsmetoder intracellulära markörer för att identifiera RGC, som producerar icke-levande celler. Dessa tekniker innefattar också långa isolationsprotokoll, så det finns brist på praktiska, standardiserade och pålitliga metoder för att erhålla och isolera RGC. Detta arbete beskriver en effektiv, omfattande och tillförlitlig metod för att isolera primära RGC från mus retinae med hjälp av ett protokoll baserat på både positiva och negativa urvalskriterier. De presenterade metoderna möjliggör den framtida studien av RGC, med målet att bättre förstå majorenMinskning av synskärpa som härrör från förlusten av funktionella RGC i neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
RGC är terminalt differentierade neuroner, och därför krävs primära celler för experiment. Utvecklingen av ett protokoll för isolering och berikning av primära murina retinala ganglionceller (RGC) är grundläggande för att avslöja mekanismerna för RGC-hälsa och degenerering in vitro . Detta är särskilt viktigt för studier som försöker generera potentiella terapier för att främja RGC-funktionen och för att minimera dödsfallet. Degenerationen av RGC är associerad med retinala degenerativa sjukdomar, såsom glaukom, diabetisk retinopati och normal åldrande. Även om de specifika cellulära mekanismer som ligger till grund för RGC-förlust är oklara, har en serie riskfaktorer identifierats. Mangel på syrebildning i det optiska nervhuvudet 1 , 2 , 3 orsakar RGC-död 4 och fungerar som störningen av homeostasen mellan aktiveringen av excitatoriska och iInhibitorer inom individuella RGC 5 , 6 . En rad utmaningar hindrar framsteg mot användningen av dessa celler för djupgående studier. För det första är antalet RGC närvarande i en murin retina liten. RGC: er svarar för mindre än 1% av de totala retinala cellerna 7 , 8 , 9 . För det andra är de flesta RGC-specifika markörer intracellulära proteiner 10 , 11 , 12 . Urval baserat på dessa markörer lämnar cellerna icke-genomförbara, vilket utesluter nedströms funktionella analyser. Slutligen är nu tillgängliga protokoll långa och saknar standardisering 13 , 14 . Tidiga RGC-isolationsprotokoll baserades på immunopanningsmetoder. Barres et al. 15 Anpassade den klassiska immunopenAnningsteknik och tillsatte ett andra steg som uteslutde monocyter och endotelceller från huvuddelen av retinala celler före positivt urval baserat på immunopositivitet mot anti-tymocytantigen (aka Thy1), en cellytmarkör. År senare, Hong et al. Kombinerade magnetiska pärlisoleringstekniker med cellsorteringsstrategier för att isolera RGC med högre renhet 16 . Användningen av magnetiska pärlor används fortfarande i många vetenskapliga tillämpningar. Tillsammans förbättrade magnetiska pärlor och flödescytometriprotokoll renheten hos isolerade celler. Emellertid har dessa reningssystem ännu inte standardiserats för isolering av murina RGC från dissocierad retinae.
Flödescytometri är en kraftfull analysmetod som mäter optiska och fluorescensegenskaper hos cellsuspensioner. Celler analyseras både kvantitativt och kvalitativt med en hög känslighetsnivå, vilket ger en mångdimensionell analys av cellföljenation. Celldiskriminering baseras på två huvudsakliga fysikaliska egenskaper: cellstorlek eller ytarea och granularitet eller intern komplexitet 17 . En mångdimensionell analys kan utföras genom att kombinera antikroppar märkta med fluorokrom som har liknande exciteringsvåglängder och olika utsläpp. Flödescytometri är snabb, reproducerbar och känslig. Multiteplaser tillåter ännu större multidimensionella analyser av enskilda celler genom flödescytometri. Det är således en attraktiv metod för studier av cytologiska prover. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) använder de multidimensionella fenotypiska skillnaderna identifierade med flödescytometri för att sortera enskilda celler i olika subpopuleringar.
Under det senaste decenniet har flera yt- och intracellulära proteiner identifierats som potentiella biomarkörer för valet av celler, inklusive neuroner. Initiala studier som försökte isolera RGC från råttor använde Thy1 som en ganglioncellL markör. Tyvärr har Thy1, aka CD90, flera isoformer i andra gnagarearter 18 , 19 , 20 och uttrycks av flera retinala celltyper 19 , 20 , vilket gör den till en icke-specifik markör för RGC. En annan ytmarkör, CD48, finns på monocytiska populationer i näthinnan, inklusive makrofager och microglia. Med användning av dessa två ytmarkörer utvecklades en modifierad RGC signatur-Thy1 + och CD48 negceller 15 , 16 , 21 , 22 . Tyvärr är dessa två urvalskriterier inte tillräckliga för att välja en mycket berikad RGC-population. För att hantera detta ouppfyllda behov utvecklades ett flödescytometriprotokoll 23 baserat på flera lager positiva och negativa urvalskriterier usiNg kända cellyta markörer för att berika och rena primära murin RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS är den valfria tekniken för att rena cellpopulationer. Andra isoleringsmetoder innefattar immunopanning, magnetiska pärlor och komplementfixeringsdepletion. Fördelen med FACS över dessa andra metoder är baserad på samtidig identifiering av cellytmarkörer med varierande intensitetsnivåer. Molekylens fluorescerande intensitet är proportionell mot mängden proteinuttryck. Hittills baserades isoleringen av RGC endast på Thy1 (CD90) positivitet och CD48 negativitet 15 , <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Tim Higgins, Senior Illustrator från Institutionen för Mikrobiologi, Immunologi och Biochemistry, för teknisk videohjälp; Dr Matthew W. Wilson för diskussioner och medlemmarna av laboratorierna Jablonski och Morales-Tirado för deras hjälpsamma kommentarer. Detta arbete stöddes av Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); Gerwin Pre-doctoral fellowship (ZKG), Institutionen för försvarsmaktens medicinska forskning och materielkommando (VMM-T) och det obegränsade bidraget från forskning för att förebygga blindhet.
Materials
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
