Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em> In Cellulo</em> Beugung

Summary

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Abstract

Das Aufkommen von hochwertigen Mikrofokus-Strahllinien bei vielen Synchrotronanlagen ermöglichte die Routineanalyse von Kristallen kleiner als 10 μm in ihrer größten Dimension, die eine Herausforderung darstellte. Wir stellen zwei alternative Arbeitsabläufe für die Strukturbestimmung von Proteinmikrokristallen durch Röntgenkristallographie mit besonderem Fokus auf in vivo gewachsene Kristalle dar. Die Mikrokristalle werden entweder durch Ultraschallbehandlung aus Zellen extrahiert und durch Differentialzentrifugation gereinigt oder in Cellulo nach Zellsortierung durch Durchflusszytometrie von kristallhaltigen Zellen analysiert. Gegebenenfalls werden gereinigte Kristalle oder kristallhaltige Zellen in schweren Atomlösungen für die experimentelle Phasierung eingeweicht. Diese Proben werden dann auf Beugungsexperimente in ähnlicher Weise durch Aufbringen auf einen Mikromesh-Träger und Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff vorbereitet. Wir beschreiben und vergleichen serielle Beugungsexperimente von isolierten Mikrokristallen und Kristall-Enthaltende Zellen, die eine Mikrofokus-Synchrotron-Strahllinie verwenden, um Datensätze zu erzeugen, die für Phasing, Modellbau und Verfeinerung geeignet sind.

Diese Arbeitsabläufe werden beispielhaft mit Kristallen des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) Polyhedrins, das durch Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus produziert wird, veranschaulicht. In diesem Fall Studie, in der Cellulo- Analyse ist effizienter als die Analyse der gereinigten Kristalle und liefert eine Struktur in ~ 8 Tage von Expression zu Verfeinerung.

Introduction

Die Verwendung der Röntgenkristallographie zur Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Makromoleküle hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen stetigen Fortschritt erfahren. Die zunehmende Aufnahme der Röntgenkristallographie durch nicht-erfahrene Forscher veranschaulicht die Demokratisierung dieses Ansatzes in vielen Bereichen der Biowissenschaften ¹ .

Historisch gesehen wurden Kristalle mit Abmessungen unter ~ 10 μm als anspruchsvoll, wenn nicht unbrauchbar, für die Strukturbestimmung betrachtet. Die zunehmende Verfügbarkeit von dedizierten Mikrofokus-Strahllinien bei Synchrotronstrahlungsquellen weltweit und technologischen Fortschritten, wie die Entwicklung von Werkzeugen zur Manipulation von Mikrokristallen, hat viel von diesen Barrieren entfernt, die den breiten Einsatz der Röntgenmikrokristallographie vereiteln. Fortschritte in der seriellen Röntgenmikrokristallographie ^{2 , 3} und Mikroelektronenbeugung ⁴ haDass die Verwendung von Mikro- und Nanokristallen zur Strukturbestimmung nicht nur möglich ist, sondern auch manchmal der Verwendung von großen Kristallen ^{5 , 6 , 7} bevorzugt ist.

Diese Fortschritte wurden zuerst auf die Untersuchung von Peptiden ⁸ und natürlichen Kristallen angewendet, die von Insektenviren ^{9 , 10 produziert wurden} . Sie werden nun für ein breites Spektrum biologischer Makromoleküle eingesetzt, darunter die schwierigsten Systeme wie Membranproteine ​​und Großkomplexe ¹¹ . Um die Analyse dieser Mikrokristalle zu erleichtern, wurden sie in Meso , insbesondere Membranproteinen ¹² und in Mikrofluidik-Chips ^13, analysiert.

Die Verfügbarkeit dieser neuartigen Mikrokristallographie-Methoden hat die Möglichkeit der Verwendung deVivo-Kristallisation als neuer Weg für die Strukturbiologie ^{14 , 15 , 16,} die eine Alternative zur klassischen in vitro- Kristallogenese bietet. Unglücklicherweise, auch wenn in vivo Kristalle produziert werden können, bleiben mehrere Hindernisse wie der Abbau oder Verlust von Liganden während der Reinigung aus Zellen, Schwierigkeiten bei der Manipulation und Visualisierung der Kristalle an der Synchrotron-Strahllinie und langwierigen Röntgenbeugungsexperimenten. Als Alternative wurden auch Kristalle direkt innerhalb der Zelle ohne Reinigungsschritt ^{17 , 18 , 19} analysiert. Eine vergleichende Analyse deutet darauf hin, dass solche in Cellulo- Ansätze effizienter sein können als die Analyse von gereinigten Kristallen und Ertragsdaten höherer Auflösung ²⁰ .

Dieses Protokoll ist inNeigten dazu, Forschern neu zu helfen, die Protein-Mikrokristallographie neu zu machen. Es bietet Methoden zur Fokussierung auf Probenvorbereitung und Manipulation für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Es werden zwei Möglichkeiten vorgeschlagen, isolierte Kristalle für klassische Mikrokristallographie oder kristallhaltige Zellen zu verwenden, die nach Durchflusszytometrie für die Celluloanalyse sortiert sind ( Abbildung 1 ).

Protocol

Anmerkung: In vivo wurde die Kristallisation in vielen Organismen beschrieben, einschließlich in Bakterien, Hefen, Pflanzen, Insekten und Säugetieren (siehe Referenz 21 ). Die Kristallisation von rekombinanten Proteinen wurde auch im Labor unter Verwendung einer transienten Transfektion von Säugetierzellen und einer Baculovirusinfektion von Insektenzellen erreicht. Das folgende Protokoll wurde unter Verwendung des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) -Polyhedrin-Gens, das in eine…

Representative Results

Eine Übersicht über beide alternativen Methoden zur Strukturbestimmung mit in vivo Mikrokristallen wird dargestellt ( Abbildung 1 ). Polyeder kann leicht durch Beschallung und Zentrifugation gereinigt werden. Aufgrund ihrer Dichte bilden sie eine Schicht am Boden des Rohres unter einer Trennschicht, die durch Pipettieren entfernt werden kann ( Abbildung 3a und 3b ). Die Probe wird dann mehreren Runden…

Discussion

Dieses Protokoll bietet zwei Ansätze zur Analyse von Mikrokristallen mit dem Ziel, die Analyse von sehr kleinen Kristallen zu erleichtern, die in der Vergangenheit übersehen worden wären.

Kritische Schritte zur Mikrokristallreinigung
Das dargestellte Protokoll wurde mit Bombyx mori CPV1 Polyhedrin optimiert, das in Sf9-Zellen als Modellsystem exprimiert wird. In vivo zeigen Mikrokristalle jedoch eine große Variabilität des mechanischen Widerstan…

Materials

Sf9 cells	Life Technologies
SF900-SFM insect medium	Life Technologies
1L cell culture flask	Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture	Eppendorf
50mL conical tubes	Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes	Eppendorf
Sonicator equiped with a 19mm probe	MSE Soniprep 150
Glass slides	Hampton Research
Hemacytometer	Sigma-Aldrich
Propidium iodide	Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter	BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens	Hampton Research
Microcentrifuge	Eppendorf
Micromesh	Mitigen		700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick	Mitigen		The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich
Trypan blue	Life Technologies
MX2 microfocus beamline	Australian Synchrotron		A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455.