혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술
Summary
이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.
Abstract
내피 세포 (EC)는 혈관 건축의 기본 구성 요소이며 혈관 성장과 개조를 매개하여 적절한 혈관 개발과 항상성을 보장합니다. 그러나 내피 계통의 계층 구조에 대한 연구 는 생체 내에서 의 행동을 직접적으로 평가할 수있을뿐 아니라 액세스를 얻기위한 도구가 없기 때문에 여전히 어려움을 겪고 있습니다. 이 결점을 해결하기 위해, 유방 지방 패드를 사용하여 혈관 신생을 연구하는 새로운 조직 모델이 개발되었습니다. 유선은 사춘기 및 임신을 포함하여 출생 후의 단계에서 주로 발생하며, 그 동안 견고한 상피 증식이 광범위한 혈관 재 형성을 동반합니다. 유방 지방 패드는 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공합니다. 또한 유방 지방 패드는 복강 외에도 위치하여 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가할 수있는 쉽게 접근 할 수있는 접목 사이트가됩니다. 이 작품은 또한 효율성in vivo에서 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 표적 집단을 특이 적으로 표지하기 위해 형광 리포터 마우스를 사용하는 nt 추적 접근법. 이 계통 추적 방법은 후속 조직 전체 장착 현미경과 결합하여 표적화 된 세포와 그 자손을 직접 시각화 할 수 있으며이를 통해 증식 능력을 정량화 할 수 있고 분화 약속을 운명 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하여 VESCs를 발현하는 양성 단백질 C 수용체 (Procr)의 개체군이 최근 여러 혈관계에서 확인되었다. Procr + VESCs는 새로운 EC와 혈관 주위 세포 모두를 일으키며, 발달, 항상성 및 상해 복구 중 혈관 신생에 적극적으로 기여합니다. 전체적으로이 원고는 VESC의 줄기 세포 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 새로운 유방 지방 패드 이식과 생체 내 혈통 추적 기술을 설명합니다.
Introduction
개발과 항상성 동안, 혈관 성장과 개조는 신실하게 기관 성장과 수리에 따라 일어납니다. 혈관 신생은 선재 혈관으로부터의 새로운 혈관 생성을 설명하며, 이러한 동적 인 혈관 변화를 중재하는 주요한 힘으로 간주된다. 각 혈관은 내피 세포 (inner cells, ECs)의 층으로 안쪽에 늘어서 있으며 혈관 건축의 기초로 보인다. 오랜 시간 동안 항상성 (homeostasis) 동안 EC pool이 보충되는 메카니즘은 여전히 명확하지 않았으며, 혈관 회전율이 성숙한 EC 증식의 결과인지 혈관 줄기 / 전구 세포 활동의 기여인지에 대한 주장이 제기되었다. 직접적인 생리 학적 증거가 없기 때문에 혈관 내피 줄기 세포 (Vascular endothelial stem cell, VESCs)의 존재와 세포 신원은 논란의 여지가있다.
줄기 세포 행동을 확인하는 데 사용되는 가장 일반적인 접근법 중 하나는 transplan추정 줄기 세포를 수령 마우스에 투여 이 방법 은 생체 내 후보 줄기 세포의 줄기 가능성을 측정합니다 . 이식은 먼저 조혈 시스템 2 의 계층 적 특징의 수립에 기여한 골수 줄기 세포 1 의 연구에 적용되었습니다. 내피 분야에서, 측면 피부 아래 피하에 삽입 된 기저막 매트릭스 ( 예 : matrigel) 플러그는 이식 된 EC의 혈관 형성 능력을 설명하기 위해 사용 된 생체 내 혈관 신생 분석 표준이었다. 3D 배양 시스템과 이식에서의 콜로니 형성을 포함한 여러 실험 방법은 잠재적 인 EC progenitor / VESC 집단을 3 , 4 , 5 , 6으로 제안했다. 그러나, 기저막 매트릭스에 내장 된 EC는 상대적으로 분리되어 있기 때문에주변 조직은 이식 된 세포의 혈관 신생 가능성을 완전히 탐색하는 데 필요한 최적의 틈새 환경을 제공하지 않습니다. 결과적으로, 매트릭스 플러그 내에 형성된 혈관은 주로 모세 혈관 유사하며 기능적으로 측정 불가능합니다.
유선은 출생 후 사춘기 및 임신 기간 동안 가장 강력한 성장을 보이며 발달합니다. 사춘기 단계에서 유방 상피는 주위의 혈관 구조물을 효과적으로 개장하는 동시에 유방 지방 패드 전체를 차지하도록 급속히 팽창합니다. 따라서 유선은 혈관 신생 연구에 훌륭한 모델입니다. 그것은 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공하며, 따라서 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가하기위한 이상적인 이식 부위이다. 또한 유방 지방 패드는 형성된 외인성 혈관이 숙주 순환 시스템과 통합되도록하여 functional 평가 및 피하 이식에 대한 이점을 나타냅니다.
시험 관내 배양 및 이식 시험은 세포 집단의 재생 특성을 조사하는 효과적인 방법이기는하지만, 세포가 원래의 서식처에서 제거됨에 따라 가소성을 자극 할 수 있으며 세포가 분리되면 변화가 유발 될 수 있음이 알려져있다 그들의 생리적 환경 7 . 그러므로 세포 내 운명의 직접적인 생체 내 증거를 얻는 것이 내피 개체군의 행동에 대한 현재의 이해를 발전시키는 핵심 접근법이다.
생체 내에서 줄기 세포의 생체 내 행동을 밝힐 수 있기 때문에 VESC의 확인과 신체 시스템의 특성 조사에 유전 학적 운명 매핑 ( 즉, 생체 내 혈통 추적)이 반드시 필요합니다. 평가했다. 계보 traci후보 VESC의 장기 지속성 ( 즉, 자가 갱신)과 기원 조직 ( 즉, 분화 효능)을위한 세포 유형을 생산할 수있는 능력에 대한 직접적인 증거를 제공한다.
이 프로토콜은 VESC의 혈관 생성 능력을 관찰하기위한 새로운 유방 지방 패드 이식 기술과 혈통 추적 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 현재 이용 가능한 분석법의 단점을 극복하고 VESC의 줄기 세포 특성을 최적으로 평가하는 새로운 방법을 제공합니다. 이러한 접근법은 병적 인 환경에서 혈관 세포 효능의 변화를 결정할뿐만 아니라 내피 집단의 행동 및 혈관 형성 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 효율적인 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈관 신생 분석은 혈관 역학을 연구하기위한 훌륭한 실험적 접근 방법입니다. 출생 개발 마우스 망막 혈관은 혈관 신생 (12)을 연구하는 매력적인 모델로 입증되었습니다. 비교적 접근하기 쉽지만 망막 혈관 내에서의 실제 조작은 다소 어렵습니다. 지금까지 가장 잘 설명 된 생체 내 이식은 수혈 마우스의 옆구리 부위에 피하로 주사하거나 주입하는 피하 시험입니다. 이러…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31530045 및 31371500, YAZ, 31401245, QCY), 중국 과학 기술부 (2014CB964800), 중국 과학원 (XDB19000000 – YAZ), 중국 세포 생물학 학회 (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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