Оценка саркоплазматический ретикулум кальция резерва и внутриклеточного кальция диастолического удаления в изолированных кардиомиоцитов желудочков

Summary

Утилизация внутриклеточного кальция играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в кардиомиоцитов. Здесь мы описываем протокол для оценки саркоплазматический ретикулум Ca^{2 +} резерв и функция удаления диастолического кальция в кардиомиоцитов, кальция, визуализации системы.

Abstract

Утилизация внутриклеточного кальция играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в кардиомиоцитов. Сердца саркоплазматический ретикулум (SR) служит как Ca^{2 +} резервуар для сжатия, который reuptakes внутриклеточный Ca^{2 +} во время отдыха. Для ударов SR Ca^{2 +} резерв Детерминантный для сердца стягиваемости, и устранению внутриклеточного Ca^{2 +} имеет решающее значение для сердца диастолической функции. В некоторых патофизиологических условиях, например сахарного диабета и сердечной недостаточности Распродажа нарушениями кальция и SR Ca^{2 +} магазин в cardiomyocytes могут быть вовлечены в процессе работы сердца дисфункции. Здесь мы описываем протокол для оценки SRCa^{2 +} резерв и диастолического Ca^{2 +} удаления. Кратко один cardiomyocyte был ферментативно изолирован, и внутриклеточных Ca^{2 +} флуоресценции обозначается фура-2 был записан кальция съемочной системы. Применять кофеин для стимулирования общей SR Ca^{2 +} релиз, мы предварительно программу переключатель Автоматическое перфузии взаимосвязанных перфузии системы и системы стимулирования. Затем моно экспоненциальной кривой был использован для анализа константы времени распада транзиентов кальция и кальция, кофеин индуцированной импульсов. Таким образом, вклад SR Ca^{2 +}-АТФазы (SERCA) и Na⁺-Ca^{2 +} теплообменник (NCX) для удаления диастолического кальция оценивалась.

Introduction

Внутриклеточного кальция ([Ca^{2 +}]_я) переработка играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в cardiomyocytes¹. Как мы знаем, кальций индуцированной Ca^{2 +} релиз инициирует возбуждения сокращение муфты, который переводить электрического сигнала, чтобы сокращение. Деполяризации мембраны активирует sarcolemmal L-типа Ca^{2 +} каналы, которые вызывают Ca^{2 +} освобождение от SR в цитоплазму через рианодиновыми рецепторов 2 (RyR2). Переходных повышенных цитоплазматических Ca^{2 +} инициирует сокращением миофибрилл. Во время фазы, цитоплазматических Ca^{2 +} является reuptaken в SR посредством SR Ca^{2 +}-АТФазы 2 (SERCA2) и закачиваются из cardiomyocyte через Na⁺-Ca^{2 +} теплообменник (NCX)². Этот процесс приводит к сокращение релаксации, переработка в cardiomyocyte.

Сердца SR является сеть внутриклеточные мембраны, которая окружает сократительной машины. Он служит Ca^{2 +} резервуар для сжатия, и он reabsorbs внутриклеточный Ca^{2 +} во время отдыха. Для ударов SR Ca^{2 +} резерв Детерминантный для сократимости сердца. Тем временем удаление внутриклеточных Ca^{2 +} имеет решающее значение для сердца диастола. В некоторых патофизиологических условиях как диабет и сердечной недостаточностью, нарушениями Ca^{2 +} распродажа и депрессии SR Ca^{2 +} магазин в cardiomyocytes могут быть вовлечены в процессе сердечной дисфункции^{2,3 ,4}.

Для измерения SR Ca^{2 +} выпуска и диастолического Ca^{2 +} удаление в кардиомиоцитов, существует два широко используемых подходов: целостность NCX тока на основе патч зажим^5,6и кофеин индуцированной Ca ^{2 +} импульса на основе Ca^{2 +} флуоресценции изображений^7,8,9. Первый подход зависит тот факт, что Ca^{2 +} освобожден от SR основном перекачивается из клетки, NCX. Однако этот подход ограничивается требованием современного оборудования и умелой эксплуатации. В настоящем исследовании мы описываем удобный подход к оценке SR Ca^{2 +} резерв и Ca^{2 +} удаление в миоциты путем измерения кофеин индуцированной Ca^{2 +} импульса на основе Ca^{2 +} флуоресценции тепловизионные системы. Вкратце внутриклеточный Ca^{2 +} флуоресценции обозначается фура-2. Путем увязки системы стимулирования и перфузии системы, мы представляем программу для переключения перфузии и электрокардиостимуляции системы автоматически. 10 мм кофеин работал быстро вызвать общее Ca^{2 +} релиз в СР. Константы времени экспоненциального распада (Тау) кальция переходные процессы и кофеин индуцированной кальция импульсы были получены из моно экспоненциальной кривой, которые отражают вклад диастолического Ca^{2 +} удаления SERCA и NCX соответственно.

Protocol

всех животных эксперименты были проведены в соответствии с протоколами, утвержденных Комитетом институциональный уход животных и использования на экспериментальный научно-исследовательский центр, Китай Академии медицинских наук и Чжэцзянский университет. 1. приготов…

Representative Results

Здесь, мы иллюстрируем Стрептозотоцин (СТЗ) – индуцированной диабетической крысы (DM) и возраст соответствует Sprague – Dawley (SD) к примеру крысы. 8-недельных самцов крыс SD (200 ± 20 г) получил однократной внутрибрюшной инъекции СТЗ (70 мг/кг, ip) для буфера цитрата или группы DM для конт…

Discussion

Кальция поток освобожден от SR является основным Ca^{2 +} источником для систолы в сердце. До некоторой степени, амплитуда SR Ca^{2 +} контента и дробные Ca^{2 +} освобожден от SR отражают SR Ca^{2 +} резерв для сердечного сокращения. С другой стороны Ca^{2 +} резерв SR зависит от способно…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436