Утилизация внутриклеточного кальция играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в кардиомиоцитов. Здесь мы описываем протокол для оценки саркоплазматический ретикулум Ca2 + резерв и функция удаления диастолического кальция в кардиомиоцитов, кальция, визуализации системы.
Утилизация внутриклеточного кальция играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в кардиомиоцитов. Сердца саркоплазматический ретикулум (SR) служит как Ca2 + резервуар для сжатия, который reuptakes внутриклеточный Ca2 + во время отдыха. Для ударов SR Ca2 + резерв Детерминантный для сердца стягиваемости, и устранению внутриклеточного Ca2 + имеет решающее значение для сердца диастолической функции. В некоторых патофизиологических условиях, например сахарного диабета и сердечной недостаточности Распродажа нарушениями кальция и SR Ca2 + магазин в cardiomyocytes могут быть вовлечены в процессе работы сердца дисфункции. Здесь мы описываем протокол для оценки SRCa2 + резерв и диастолического Ca2 + удаления. Кратко один cardiomyocyte был ферментативно изолирован, и внутриклеточных Ca2 + флуоресценции обозначается фура-2 был записан кальция съемочной системы. Применять кофеин для стимулирования общей SR Ca2 + релиз, мы предварительно программу переключатель Автоматическое перфузии взаимосвязанных перфузии системы и системы стимулирования. Затем моно экспоненциальной кривой был использован для анализа константы времени распада транзиентов кальция и кальция, кофеин индуцированной импульсов. Таким образом, вклад SR Ca2 +-АТФазы (SERCA) и Na+-Ca2 + теплообменник (NCX) для удаления диастолического кальция оценивалась.
Внутриклеточного кальция ([Ca2 +]я) переработка играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в cardiomyocytes1. Как мы знаем, кальций индуцированной Ca2 + релиз инициирует возбуждения сокращение муфты, который переводить электрического сигнала, чтобы сокращение. Деполяризации мембраны активирует sarcolemmal L-типа Ca2 + каналы, которые вызывают Ca2 + освобождение от SR в цитоплазму через рианодиновыми рецепторов 2 (RyR2). Переходных повышенных цитоплазматических Ca2 + инициирует сокращением миофибрилл. Во время фазы, цитоплазматических Ca2 + является reuptaken в SR посредством SR Ca2 +-АТФазы 2 (SERCA2) и закачиваются из cardiomyocyte через Na+-Ca2 + теплообменник (NCX)2. Этот процесс приводит к сокращение релаксации, переработка в cardiomyocyte.
Сердца SR является сеть внутриклеточные мембраны, которая окружает сократительной машины. Он служит Ca2 + резервуар для сжатия, и он reabsorbs внутриклеточный Ca2 + во время отдыха. Для ударов SR Ca2 + резерв Детерминантный для сократимости сердца. Тем временем удаление внутриклеточных Ca2 + имеет решающее значение для сердца диастола. В некоторых патофизиологических условиях как диабет и сердечной недостаточностью, нарушениями Ca2 + распродажа и депрессии SR Ca2 + магазин в cardiomyocytes могут быть вовлечены в процессе сердечной дисфункции2,3 ,4.
Для измерения SR Ca2 + выпуска и диастолического Ca2 + удаление в кардиомиоцитов, существует два широко используемых подходов: целостность NCX тока на основе патч зажим5,6и кофеин индуцированной Ca 2 + импульса на основе Ca2 + флуоресценции изображений7,8,9. Первый подход зависит тот факт, что Ca2 + освобожден от SR основном перекачивается из клетки, NCX. Однако этот подход ограничивается требованием современного оборудования и умелой эксплуатации. В настоящем исследовании мы описываем удобный подход к оценке SR Ca2 + резерв и Ca2 + удаление в миоциты путем измерения кофеин индуцированной Ca2 + импульса на основе Ca2 + флуоресценции тепловизионные системы. Вкратце внутриклеточный Ca2 + флуоресценции обозначается фура-2. Путем увязки системы стимулирования и перфузии системы, мы представляем программу для переключения перфузии и электрокардиостимуляции системы автоматически. 10 мм кофеин работал быстро вызвать общее Ca2 + релиз в СР. Константы времени экспоненциального распада (Тау) кальция переходные процессы и кофеин индуцированной кальция импульсы были получены из моно экспоненциальной кривой, которые отражают вклад диастолического Ca2 + удаления SERCA и NCX соответственно.
Кальция поток освобожден от SR является основным Ca2 + источником для систолы в сердце. До некоторой степени, амплитуда SR Ca2 + контента и дробные Ca2 + освобожден от SR отражают SR Ca2 + резерв для сердечного сокращения. С другой стороны Ca2 + резерв SR зависит от способно…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана субсидий из национального фонда естественных наук Китая (№ 81100159, Dongwu Лай; 81401147, Чжан Juhong), медицинских и здравоохранения наук программа из провинции Чжэцзян (№ 201646246, Dongwu Лай) и медицинских наук и Технология план города Ханчжоу (№ 2013A28, Дин Лин).
NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
BSA | Roche | 735094 | |
caffeine | Sigma | C0750 | |
Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |