Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses
Summary
Hier rapporteren we een protocol voor het ontwikkelen van een driedimensionaal (3-D) systeem van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het serumvrije embryoïde lichaam (SFEB) genoemd. Dit 3-D model kan gebruikt worden als een organotypische plakcultuur om menselijke corticale ontwikkeling te modelleren en voor de fysiologische ondervraging van neurale ontwikkelingen.
Abstract
Hoewel een aantal in vitro ziekte modellen is ontwikkeld met behulp van hiPSCs, is één beperking dat deze tweedimensionale (2-D) systemen niet de onderliggende cytoarchitectural en functionele complexiteit van de getroffen personen kunnen voorstellen die vermoedelijke ziektevarianten dragen. Conventionele 2-D modellen blijven onvolledige representaties van in vivo- achtige structuren en behalen de complexiteit van de hersenen niet voldoende. Zo is er een opkomende behoefte aan meer 3-D hiPSC-gebaseerde modellen die de cellulaire interacties en functies die in een in vivo systeem worden gezien, beter kunnen herkapituleren.
Hier rapporteren we een protocol om een 3-D systeem te ontwikkelen van ongedifferentieerde hiPSCs op basis van het serumvrije embryoidlichaam (SFEB). Dit 3-D model weerspiegelt aspecten van een ontwikkelde geventraliseerde neocortex en maakt het mogelijk om te onderzoeken naar functies die integreren in levende neurale cellen en intact weefsel zoals migratie, connectiviteit, communicatie en matUUR. Specifiek wijzen wij aan dat de SFEB's die ons protocol gebruiken kunnen worden ondervraagd met behulp van fysiologisch relevante en hoogwaardige cel gebaseerde assays, zoals calciumbeelden en multi-electrode array (MEA) opnames zonder cryosectie. In het geval van MEA-opnamen tonen we aan dat SFEB's zowel spijkeractiviteit als netwerkbreukactiviteit verhogen tijdens de lange termijn cultuur. Dit SFEB protocol biedt een robuust en schaalbaar systeem voor de studie van het ontwikkelen van netwerkvorming in een 3-D model dat aspecten van de vroege corticale ontwikkeling vastlegt.
Introduction
We hebben eerder een 3-D model systeem gemeld, geproduceerd door patiëntgerelateerde door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) die sommige aspecten van de vroege corticale netwerkontwikkeling 1 herhaalt. Dit 3-D model, een serumvrij embryoidlichaam (SFEB), verbetert bij eerdere eenvoudige aggregatie hiPSC modellen 2 , 3 . Een groeiend werkstuk laat zien dat 3-D structuren zoals onze SFEB's, benaderende aspecten van neurale ontwikkeling die in vivo en op een vroeger tijdstip algemeen waargenomen worden, dan waargenomen in 2-D-dimensionale (2-D) / monolaag hiPSC modellen 4 , 5 . Initiële studies zijn gericht op de zelf-organiserende complexiteit van 3-D lichamen zonder hun fysiologische complexiteit 2 aan te tonen .
Het hier beschreven protocol is toegepast op ongedifferentieerde hiPSCs afgeleid van fibroblasten en Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's). Deze cellen worden gehandhaafd op y-bestraalde muis embryonale voeders (MEF's). Deze hiPSC kolonies worden handmatig gereinigd van spontaan gedifferentieerde cellen, enzymatisch geoogst en geresuspendeerd in medium dat Rho-Kinase inhibitor Y-27632 (ROCKi) bevat. Niet-gedifferentieerde hiPSC's worden onderworpen aan dissociatie en centrifugatie voordat ze worden overgebracht naar 96-putjes met lage hechting V-bodemplaten. Na plating wordt neurale inductie ingeleid door gebruik te maken van dubbele SMAD remming (SB431542 en LDN193189, samen met dickkopf 1 (DKK-1)) om een neuronale-afwijking van anterior-frontale voorhoofd 6 te leiden . Na 14 dagen worden de SFEB's overgebracht naar celkweekinzetten in een 6-putjesplaat. Eenmaal overgebracht, beginnen de ronde SFEB's te verspreiden en dunken, terwijl lokale netwerkverbindingen worden gehandhaafd, zoals vaak wordt waargenomen in hippocampale organotypische plakcultuurpreparaten onder gebruikmaking van vergelijkbare celkweekinzetten 1 ,Ss = "xref"> 7.
Het gebruik van een SFEB-gebaseerd 3-D-platform in dit formaat is vatbaar voor de efficiënte productie van corticale netwerken die geïnterviewd kunnen worden met behulp van cel gebaseerde fysiologische analyses, zoals calciumbeeldvorming of elektrofysiologische analyses, zoals single-cell opnames of multi-electrode array (MEA ) 1 . Hoewel 3-D-systemen de markers van vroege corticale ontwikkeling dragen, hebben andere studies aangetoond dat deze 3-D-lichamen langer incubatietijden nodig hebben om het inherent langzamere tempo van de ontwikkeling van menselijk weefsel te kunnen veroorzaken 8 . Dit SFEB protocol genereert succesvol 3-D SFEB's van ongedifferentieerde hiPSCs die aspecten van de vroege ontwikkeling van de cortex vastleggen.
Het potentieel van SFEB's om netwerkafwijkingen in neurologische aandoeningen te modelleren is een kracht van dit systeem. De hiPSC's afgeleid van patiëntweefsel kunnen worden gekweekt in cellen van het zenuwstelsel dat onderworpen zijn aan ezelAys die betrekking hebben op celbiologie evenals gelijktijdige genexpressie. Menselijke iPSC's worden gebruikt om het genetische profiel van grote groepen individuen met verschillende neurologische aandoeningen te bepalen met complexe etiologieën zoals autisme spectrum stoornis (ASD), schizofrenie 9 , Rett syndroom 10 en de ziekte van Alzheimer 11 , 12 . Tot voor kort waren iPSC-modellen typisch monolaagpreparaten die, hoewel geschikt voor het evalueren van moleculaire interacties, onvoldoende waren in het ontcijferen van de complexe cellulaire interacties die in vivo werden gezien. Diermodellen zijn de standaardvervanger voor het herstellen van het hele orgelplatform. Deze diermodellen worden geplaagd door een slechte vertaling van bevindingen en hebben een beperkte mogelijkheid om menselijke genetische profielen te identificeren die zijn geïdentificeerd door grote genetische screeningsstudies. Zo voegt de ontwikkeling van 3-D systemen van iPSCs een vereiste laag van complexiteit in het menselijk toeZiekte modelleren 13 , 14 . De volgende stap voor 3D-hiPSC-platforms is om de grote schaalvereisten van high-throughput screening op te vangen met behulp van cel gebaseerde assays 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol geeft de voorwaarden om een hiPSC bron te differentiëren in een 3-D structuur die een vroeg stadium van ontwikkeling van de frontale cortex recapituleert. Deze procedure levert structuren op die kunnen worden ondervraagd voor elektrofysiologie, terwijl ze ook voor microscopie vatbaar zijn. De uiteindelijke morfologie van het SFEB lijkt op die van organotypische breinschijfculturen en zorgt voor hoge kwaliteit gedetailleerde confocal beeldvorming. Dit protocol kan SFEB's succesvol …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Elizabeth Benevides voor het proeflezen van het artikel. Wij danken Drs. John Hussman en Gene Blatt voor hun goede discussies en opmerkingen.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
