Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays
Summary
Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.
Abstract
Obwohl eine Reihe von In-vitro- Erkrankungsmodellen unter Verwendung von hiPSCs entwickelt worden ist, ist eine Einschränkung, dass diese zweidimensionalen (2-D) -Systeme nicht die zugrunde liegende zytoarchitektonische und funktionelle Komplexität der betroffenen Individuen darstellen, die vermutete Krankheitsvarianten tragen. Konventionelle 2-D-Modelle bleiben unvollständige Darstellungen von in vivo- artigen Strukturen und erfassen die Komplexität des Gehirns nicht adäquat. So gibt es einen neuen Bedarf an mehr 3-D-hiPSC-basierten Modellen, die die zellulären Wechselwirkungen und Funktionen, die in einem In-vivo- System gesehen werden, besser rekapitulieren können.
Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines 3-D-Systems aus undifferenzierten HIPSCs basierend auf dem serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell spiegelt Aspekte eines sich entwickelnden ventralisierten Neocortex und ermöglicht Studien in Funktionen integraler Bestandteil der lebenden neuronalen Zellen und intakten Gewebe wie Migration, Konnektivität, Kommunikation und MatteUration Speziell zeigen wir, dass die SFEBs, die unser Protokoll verwenden, unter Verwendung physiologisch relevanter und hochinhaltszellbasierter Assays wie Calcium-Imaging und Multi-Elektroden-Array (MEA) -Aufzeichnungen ohne Kryoschaltung abgefragt werden können. Im Fall von MEA-Aufnahmen zeigen wir, dass SFEBs während der langfristigen Kultivierung sowohl die Spike-Aktivität als auch die auf Wachstumsebene beruhigende Aktivität erhöhen. Dieses SFEB-Protokoll bietet ein robustes und skalierbares System für die Untersuchung der Entwicklung der Netzwerkbildung in einem 3-D-Modell, das Aspekte der frühen kortikalen Entwicklung erfasst.
Introduction
Wir haben bereits ein 3-D-Modellsystem gemeldet, das aus patientenorientierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erzeugt wurde, die einige Aspekte der frühen kortikalen Netzwerkentwicklung zusammenfassen 1 . Dieses 3-D-Modell, ein serumfreier Embryoidkörper (SFEB), verbessert die bisherigen einfachen Aggregations-HIPSC-Modelle 2 , 3 . Ein wachsender Körper der Arbeit zeigt, dass 3-D-Strukturen wie unsere SFEBs, ungefähre Aspekte der neuralen Entwicklung, die in vivo und zu einem früheren Zeitpunkt beobachtet werden, als in den zweidimensionalen (2-D) / Monolayer-hiPSC-Modellen 4 , 5 beobachtet wurden . Die anfänglichen Studien konzentrierten sich auf die selbstorganisierende Komplexität von 3-D-Körpern, ohne ihre physiologische Komplexität zu demonstrieren 2 .
Das hier beschriebene Protokoll wurde auf undifferenzierten HiPSCs aus Fibroblasten und Peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Diese Zellen werden auf γ-bestrahlten Maus-Embryonal-Feedern (MEFs) gehalten. Diese hiPSC-Kolonien werden manuell von spontan differenzierten Zellen gereinigt, enzymatisch geerntet und in Medium, das den Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (ROCKi) enthält, resuspendiert. Undifferenzierte hiPSCs werden einer Dissoziation und Zentrifugation unterworfen, bevor sie auf 96-Well-Niedrigadhäsions-V-Bodenplatten übertragen werden. Nach dem Plattieren wird die neuronale Induktion mittels Dual-SMAD-Hemmung (SB431542 und LDN193189 zusammen mit dickkopf 1 (DKK-1)) initiiert, um eine anterior-frontale Vorderhirn-Neuronal-Schicksalslinie 6 zu treiben. Nach 14 Tagen werden die SFEBs in Zellkultureinsätze in eine 6-Well-Platte überführt. Einmal übertragen, beginnen die runden SFEBs zu verbreiten und zu dünn, während die Aufrechterhaltung lokaler Netzwerkverbindungen, wie es häufig in hippocampalen organotypischen Scheibenkulturpräparaten unter Verwendung ähnlicher Zellkultureinsätze 1 ,Ss = "xref"> 7
Die Verwendung einer SFEB-basierten 3-D-Plattform in diesem Format ist der effizienten Herstellung von kortikalen Netzwerken zugänglich, die unter Verwendung von zellbasierten physiologischen Assays wie z. B. Calcium-Imaging oder elektrophysiologische Assays wie Einzelzell-Aufnahmen oder Multi-Elektroden-Array (MEA) abgefragt werden können ) 1 . Obwohl 3-D-Systeme die Marker der frühen kortikalen Entwicklung tragen, haben andere Studien gezeigt, dass diese 3-D-Körper längere Inkubationszeiten benötigen, um das inhärent langsamere Tempo der Entwicklung des menschlichen Gewebes zu ermöglichen 8 . Dieses SFEB-Protokoll generiert erfolgreich 3-D-SFEBs aus undifferenzierten hiPSCs, die Aspekte der frühen Entwicklung der Kortex erfassen.
Das Potenzial von SFEBs, Netzwerk-Aberrationen bei neurologischen Störungen zu modellieren, ist eine Stärke dieses Systems. Die aus dem Patientengewebe gewonnenen hiPSCs können in Zellen des Nervensystems gezüchtet werden, die dem Arsch unterworfen sindAys in Bezug auf die Zellbiologie sowie die gleichzeitige Genexpression. Human-iPSCs werden verwendet, um das genetische Profil von großen Gruppen von Individuen mit unterschiedlichen neurologischen Störungen mit komplexen Ätiologien wie Autismus-Spektrum-Störung (ASD), Schizophrenie 9 , Rett-Syndrom 10 und Alzheimer-Krankheit 11 , 12 zu ermitteln . Bis vor kurzem waren iPSC-Modelle typischerweise Monolayer-Präparate, die bei der Bewertung molekularer Wechselwirkungen bei der Entschlüsselung der in vivo beobachteten komplexen zellulären Wechselwirkungen unzureichend waren. Tiermodelle sind der Standard-Ersatz für die Wiederherstellung der Ganz-Organ-Plattform. Diese Tiermodelle werden von einer schlechten Übersetzung der Befunde geplagt und haben eine begrenzte Fähigkeit, menschliche genetische Profile zu replizieren, die durch große genetische Screening-Studien identifiziert wurden. So fügt die Entwicklung von 3-D-Systemen von iPSCs eine erforderliche Schicht von Komplexität in menschlichen hinzuKrankheitsmodellierung 13 , 14 . Der nächste Schritt für 3D-hiPSC-Plattformen ist es, den großtechnischen Anforderungen des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung von zellbasierten Assays 15 Rechnung zu tragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll liefert die Bedingungen für die Differenzierung einer HiFi-Quelle in eine 3-D-Struktur, die eine frühe Entwicklungsstufe des frontalen Kortex rekapituliert. Diese Prozedur liefert Strukturen, die für die Elektrophysiologie abgefragt werden können, während sie auch der Mikroskopie zugänglich sind. Die endgültige Morphologie des SFEB ähnelt der von organotypischen Hirnscheibenkulturen und ermöglicht eine qualitativ hochwertige, konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll kann erfolgreic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Elizabeth Benevides für den Korrekturlesen des Artikels. Wir danken Drs. John Hussman und Gene Blatt für ihre hilfreichen Diskussionen und Kommentare.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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