Utveckling av HiPSC-härledda serumfria embryoidorgan för undersökning av 3-D stamceller med användning av fysiologiskt relevanta analyser
Summary
Här rapporterar vi ett protokoll för att utveckla ett tredimensionellt (3-D) system från humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som kallas serumfri embryoidkropp (SFEB). Denna 3-D-modell kan användas som en organotypisk skivkultur för att modellera mänsklig kortikal utveckling och för fysiologisk utfrågning av utveckling av neurala kretsar.
Abstract
Även om ett antal in vitro- sjukdomsmodeller har utvecklats med hjälp av hiPSC, är en begränsning att dessa tvådimensionella (2-D) system inte representerar den underliggande cytoarkitektural och funktionella komplexiteten hos de drabbade individerna som bär misstänkta sjukdomsvarianter. Konventionella 2-D-modeller förblir ofullständiga representationer av in vivo- liknande strukturer och tar inte tillfredsställande in hjärnans komplexitet. Således finns det ett växande behov av fler 3-D hiPSC-baserade modeller som bättre kan rekapitulera de cellulära interaktionerna och funktionerna som ses i ett in vivo- system.
Här rapporterar vi ett protokoll för att utveckla ett 3-D-system från odifferentierade hiPSCs baserat på serumfri embryoidkroppen (SFEB). Denna 3-D-modell speglar aspekter av en utvecklande ventraliserad neocortex och möjliggör studier av funktioner som är integrerade i levande neurala celler och intakt vävnad, såsom migration, anslutning, kommunikation och mattauration. Specifikt visar vi att SFEB: erna som använder vårt protokoll kan ifrågasättas med hjälp av fysiologiskt relevanta och höghaltiga cellbaserade analyser, såsom kalciumavbildning, och MEA-inspelningar med flera elektroder utan kryosektion. När det gäller MEA-inspelningar visar vi att SFEB ökar både spikaktivitet och nätverksbristningsaktivitet under långsiktig odling. Detta SFEB-protokoll tillhandahåller ett robust och skalbart system för studier av utveckling av nätverksbildning i en 3-D-modell som fångar in aspekter av tidig kortikal utveckling.
Introduction
Vi har tidigare rapporterat ett 3-D-modellsystem, genererat av patient-härledda humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som rekapitulerar vissa aspekter av tidig kortisk nätverksutveckling 1 . Denna 3-D-modell, en serumfri embryoidkropp (SFEB), förbättras vid tidigare enkla aggregering av hiPSC-modellerna 2 , 3 . En växande arbetsgrupp avslöjar att 3-D-strukturer som våra SFEB, ungefärliga aspekter av neural utveckling som vanligen observerades in vivo och vid en tidigare tidpunkt än observerad i 2-D-dimensionella (2-D) / monolag-hiPSC-modellerna 4 , 5 . Initiala studier har fokuserats på den självorganiserande komplexiteten hos 3-D-kroppar utan att demonstrera deras fysiologiska komplexitet 2 .
Protokollet som beskrivits här har använts på odifferentierade hiPSCs härledda från fibroblaster och Perifera blodmononukleära celler (PBMC). Dessa celler bibehålls på y-bestrålade musembryonmatare (MEF). Dessa hiPSC-kolonier rengörs manuellt av spontant differentierade celler, skördas enzymatiskt och resuspenderas i medium innehållande Rho-Kinase-hämmare Y-27632 (ROCKi). Ockifferentierade hiPSCs utsätts för dissociation och centrifugering innan de överförs till 96-brunnars låghäftande V-bottenplattor. Efter plätering initieras neuralt induktion med användning av dubbel SMAD-inhibering (SB431542 och LDN193189 tillsammans med dickkopf 1 (DKK-1)) för att driva en främre-frontal-förebyggande neuronal-ödetlinje 6 . Efter 14 dagar överförs SFEB: erna till cellodlingsinsatser i en 6-brunnsplatta. När de överförts börjar de runda SFEB-spridningarna spridas och tunna samtidigt som de upprätthåller lokala nätverksanslutningar, vilket ofta observeras i hippocampala organotypa skivkulturförberedelser med användning av liknande cellodlingsinsatser 1 ,Ss = "xref"> 7.
Användningen av en SFEB-baserad 3-D-plattform i detta format är mottaglig för effektiv produktion av kortikala nätverk som kan ifrågasättas med användning av cellbaserade fysiologiska analyser såsom kalciumbildnings-eller elektrofysiologiska analyser såsom enkla cellinspelningar eller multiselektrodsuppsättning (MEA ) 1 . Trots att 3-D-system har markörer för tidig kortikal utveckling har andra studier visat att dessa 3-D-kroppar kan kräva längre inkubationstider för att möjliggöra den i sig långsammare utvecklingen av mänsklig vävnad 8 . Detta SFEB-protokoll genererar framgångsrikt 3-D SFEB från odefinierade hiPSCs som fångar aspekter av den tidiga utvecklingen av cortexen.
SFEB: s potential att modellera nätverksavvikelser i neurologiska störningar är en styrka i detta system. HiPSCs härledda från patientvävnad kan odlas till celler i nervsystemet som är föremål för rövAys relaterade till cellbiologi såväl som samtidig genuttryck. Humana iPSCs används för att fastställa den genetiska profilen hos stora grupper av individer med varierande neurologiska störningar med komplexa etiologier, såsom autismspektrumstörning (ASD), schizofreni 9 , Rett syndrom 10 och Alzheimers sjukdom 11 , 12 . Fram till nyligen var iPSC-modeller typiskt monoskiktpreparat som, trots att de var skickliga vid utvärdering av molekylära interaktioner, var otillräckliga vid dechifiering av de komplexa cellulära interaktionerna som ses in vivo . Djurmodeller har varit standardutbytet för att återskapa hela orgelplattformen. Dessa djurmodeller plågas av dålig översättning av fynd och har begränsad förmåga att replikera mänskliga genetiska profiler identifierade genom stora genetiska screeningsstudier. Således lägger utvecklingen av 3-D-system från iPSCs ett behov av komplexitet i människanSjukdomsmodellering 13 , 14 . Nästa steg för 3D-hiPSC-plattformar är att tillgodose de stora skalkraven för hög genomströmningsskärmning med användning av cellbaserade analyser 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillhandahåller förutsättningarna för differentiering av en hiPSC-källa till en 3-D-struktur som rekapitulerar ett tidigt utvecklingsstadium av den främre cortexen. Detta förfarande ger strukturer som kan ifrågasättas för elektrofysiologi samtidigt som de är mottagliga för mikroskopi. SFEB: s sista morfologi liknar den för organotypiska hjärnskivkulturer och möjliggör högkvalitativ detaljerad konfokalbildning. Detta protokoll kan framgångsrikt generera SFEBer från både f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Elizabeth Benevides för korrekturläsning av artikeln. Vi tackar Drs. John Hussman och Gene Blatt för deras hjälpsamma diskussioner och kommentarer.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
