Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores
Summary
Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.
Abstract
Este protocolo descreve a amostragem não-invasiva de fluido de mucosa das vias aéreas superiores não perturbadas. Ele também detalha o procedimento de extracção utilizado antes da análise dos mediadores imunes em eluídos fluidos para o estudo da via aérea tópica imune assinatura, sem a necessidade de procedimentos de estimulação (frequentemente usados por outras técnicas). O fluido de mucosa é amostrado em uma tira de papel de filtro colocado na parte anterior do corneto e esquerdo por 2 min de absorção inferior. Analitos são eluídos dos papéis de filtro, e os eluídos extraídos à base de proteínas são analisados por um imunoensaio baseado em eletroquimioluminescência, permitindo a quantificação de alta sensibilidade de analitos de baixo e de alto nível na mesma amostra. Medimos os níveis na vivo de 20 mediadores imunes pré-selecionadas relacionados com imunológico específico sinalização de caminhos na mucosa das vias aéreas superiores, mas a técnica não está limitada a esse painel específico ou local de amostragem. A técnica foi primeiramente implementada em crianças de 7 anos desde os estudos prospectivos de Copenhaga sobre asma em coorte de2000 (COPSAC2000) de infância com rinite alérgica. Posteriormente foi usado no COPSAC2010 nascimento coorte longitudinal, amostrada em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Estamos com sucesso obtidas e analisadas amostras de 620 (89%) de 700 crianças de 1 mês de idade; algumas amostras estavam abaixo do limite de detecção do ensaio (relatado como a mediana (intervalo inter-quartil (IQR)). O número de amostras abaixo do limite de detecção (ou seja, de 0 até o ponto de ajuste para o limite inferior de detecção) para cada mediador foi 29 (7.25-119,5). Esta técnica permite a quantificação do vivo em vias aéreas da mucosa imune perfil desde o nascimento, pode ser aplicada no sentido longitudinal e pode ser aplicada a estudos sobre o efeito da genética e exposições ambientais iniciais de vida, fisiopatologia, endotyping e monitoramento de doenças respiratórias e desenvolvimento e avaliação de novas terapêuticas.
Introduction
O fluido da mucosa do nariz torna-se a parte líquida do sistema superior-das vias respiratórias. Consiste de uma matriz complexa de mediadores derivado a interação entre o epitélio e as células imunitárias que compõem a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos. A mucosa nasal é facilmente acessível, e há uma forte relação funcional e imunológica entre o nariz e os brônquios1. Este compartimento é de especial interesse em relação às doenças das vias respiratórias que são comuns na infância, como asma e rinite alérgica, mas também a uma gama de outras doenças respiratórias mais prevalentes mais tarde na vida.
Aqui, descrevemos a implementação de um método para amostra intacta da mucosa revestimento fluido da cavidade nasal usando uma técnica não-invasiva, baseada em papel de filtro, bem como um procedimento de extração subsequente, usada para eluir analitos baseados em proteína dos papéis de filtro antes da sua quantificação. Esta técnica por exemplo, pode ser usada para obter na vivo assinaturas imunes de indivíduos saudáveis e indivíduos com várias doenças respiratórias. Além disso, é possível examinar as exposições de importância para uma assinatura específica imune e avaliar se é um preditor ou mediador do desenvolvimento posterior da doença.
Fluido de mucosa anteriormente tiver sido obtido por lavagem nasal2, que muitas vezes é precedida por um teste de desafio nasal, onde um alérgeno é introduzido em níveis elevados para estimular uma resposta inflamatória3,4. No entanto, a técnica de lavagem nasal não é viável em crianças pequenas e introduz um factor de diluição desconhecido, que confunde os resultados, como o mediador diluído níveis podem cair abaixo do limite de detecção do ensaio5. Além disso, devido ao fator de diluição desconhecido, as analito medida respostas dos testes desafio nasal não são comparáveis entre indivíduos, limitando assim a utilidade da técnica de lavagem nasal em uma coorte de configuração. Finalmente, desafio de alérgeno só é aplicável em indivíduos sensibilizados e outros desafios, como o desafio de histamina, não são fisiologicamente relevantes, potencialmente causando um efeito de teto na liberação de mediador. Estes problemas são contornados na técnica apresentada em papel de filtro para recolha de fluidos de mucosa, onde a individual secreção de fluidos e níveis de analito são apenas fatores que influenciam a variação inter-individual.
Durante o procedimento de extração, analitos são eluídos dos papéis de filtro após a adição de volumes idênticos de buffer para todas as amostras. Isso favorece semelhante ex vivo diluição das amostras. Uma solução tampão de solução salina isotônica baseada em albumina é usado para a etapa de extração; permite a extração de mediadores à base de proteínas e estabiliza as proteínas para limitar a desnaturação durante o congelamento subsequente de proteínas eluted antes da quantificação. Para evitar a degradação proteica durante a fase de extração, um coquetel de inibidores de protease é adicionado para o buffer de extração.
A implementação de técnicas que permitem a quantificação do intacta, na vivo-mediadores imunes gerados em locais da mucosa é de extrema importância. Primeiro, o site da mucosa torna-se o maior órgão imunológico no corpo. Em segundo lugar, a localização nasal é o principal local de exposição no ar e está firmemente conectada ao compartimento imunológicas respiratórias dos pulmões1. Em terceiro lugar, a possibilidade de levantamento deste órgão importante com uma técnica não-invasiva abre a possibilidade de fornecer uma infinidade de informações sobre o eixo importante interação micróbio imune em relação à saúde e doença nas vias aéreas. Em quarto lugar, existem muitas outras possíveis aplicações desta técnica, tais como estudar alterações imunológicas locais em experimentações randomized, controladas de drogas e micronutrientes.
Inicialmente implementamos a técnica nos estudos prospectivos Copenhague sobre asma em coorte de2000 (COPSAC2000) de infância, onde determinamos o perfil imunológico do fluido em crianças de 7 anos de idade com rinite alérgica versus controles saudáveis13mucosa. Posteriormente, com êxito aplicamos esta técnica à coorte longitudinal de2010 COPSAC e imune perfis das vias respiratórias avaliados em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Resultados de neonatos a 1 mês de idade demonstraram importantes associações entre a assinatura imune e a exposição ambiental do início da vida7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com a técnica apresentada aqui, éramos capazes de determinar na vivo superior-via aérea da mucosa imune perfil em crianças desde o início como 1 mês de idade, que não foi feito anteriormente. Observamos que a presença de bactérias específicas das vias respiratórias e picornaviruses7,11, bem como outros pré e perinatais exposições, foram espelhadas no perfil imune dos recém-nascidos das vias respiratórias. Além disso, usamos esses dados d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expressamos a nossa gratidão para as crianças e famílias do estudo coorte COPSAC2010 por todo seu apoio e compromisso. Reconhecemos e apreciamos os esforços exclusivos da equipa de investigação de COPSAC e a ajuda técnica do técnico Lisbeth Buus Rosholm, da Universidade Técnica da Dinamarca, para a medição de citocinas e quimiocinas.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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