Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles
Summary
Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.
Abstract
Este protocolo describe el muestreo no invasivo del líquido de revestimiento mucosa vía aérea superior. También detalla el procedimiento de extracción utilizado antes el análisis de mediadores inmunes en eluídos de fluido para el estudio de la firma inmune tópica vía aérea, sin la necesidad de procedimientos de estimulación (de uso frecuente por otras técnicas). El líquido de revestimiento mucoso se muestrea en una tira de papel de filtro colocado en la parte anterior del cornete y a la izquierda por 2 min de absorción inferior. Los analitos se eluyen de los papeles de filtro, y el eluatos basados en proteínas extraídas son analizadas por un inmunoensayo basado en electrochemiluminescence, teniendo en cuenta la alta sensibilidad cuantificación de analitos de bajo y alto nivel en la misma muestra. Medimos los niveles de en vivo de 20 preseleccionados mediadores inmunes relacionadas con inmune específico señalización de vías en la mucosa de las vías respiratorias superiores, pero la técnica no se limita a ese grupo específico o sitio de muestreo. La técnica se implementó por primera vez en niños de 7 años de los estudios prospectivos de Copenhague sobre el asma en cohorte de2000 (COPSAC2000) infancia con rinitis alérgica. Después de eso fue utilizada en la longitudinal COPSAC2010 cohorte, muestreada en 1 mes, 2 años y 6 años de edad y en casos de síntomas respiratorios agudos. Con éxito obtuvieron y analizaron muestras de 620 (89%) de 700 niños de 1 mes de edad, algunas muestras fueron por debajo del límite de detección del ensayo (reportado como mediana (rango del intercuartil (IQR)). El número de muestras por debajo del límite de detección (es decir, desde 0 hasta el punto de set para el límite inferior de detección) para cada mediador fue 29 (7.25-119.5). Esta técnica permite la cuantificación de la vivo en perfil inmune mucosa de las vías respiratorias desde el nacimiento, puede ser aplicada longitudinalmente y puede ser aplicada a estudios sobre el efecto de la genética y vida temprana exposición a riesgos ambientales, Fisiopatología, endotyping y seguimiento de enfermedades respiratorias, desarrollo y evaluación de nuevos tratamientos.
Introduction
El líquido de revestimiento mucosa de la nariz es la parte líquida del sistema de vías respiratorias superiores. Consiste en una matriz compleja de mediadores derivados de la interacción entre el epitelio y las células inmunes que conforman la primera línea de defensa contra la invasión de microorganismos. La mucosa nasal es fácilmente accesible, y hay una fuerte relación funcional e inmunológica entre la nariz y los bronquios1. Este compartimiento es de especial interés en relación con enfermedades de las vías respiratorias que son comunes en la infancia, como el asma y la rinitis alérgica, pero también a una gama de otros desordenes respiratorios más frecuentes más tarde en la vida.
Aquí, describimos la aplicación de un método a la muestra mucosa de revestimiento líquido de la cavidad nasal mediante una técnica no invasiva basada en papel de filtro, así como un procedimiento posterior extracción, utilizados a fin de eluir analitos basados en proteína de los papeles de filtro antes de su cuantificación. Esta técnica puede, por ejemplo, se solía obtener en vivo firmas inmunes de individuos sanos e individuos con enfermedades respiratorias diversas. Además, es posible examinar la exposición de la importancia de una firma inmune específica y evaluar si es un predictor o mediador del desarrollo posterior de la enfermedad.
Mucosa revestimiento líquido previamente se ha obtenido por lavado nasal2, que a menudo es precedido por una prueba de reto nasal, donde se introduce un alérgeno en niveles altos para estimular una respuesta inflamatoria3,4. Sin embargo, la técnica de lavado nasal no es factible en niños y presenta un factor de dilución desconocido, que confunde los resultados, como el mediador diluido los niveles pueden caer por debajo del límite de detección del ensayo5. Por otra parte, debido al factor de dilución desconocido, las respuestas del analito medido de las pruebas de reto nasal no son comparables entre los individuos, limitando la utilidad de la técnica de lavado nasal en una cohorte de ajuste. Finalmente, reto alergénico es solamente aplicable en sujetos sensibilizados, y otros desafíos, como el desafío de histamina, no son fisiológicamente relevantes, potencialmente causando un efecto de techo en la liberación del mediador. Estos problemas son eludidos en la técnica presentada en papel de filtro para guarnición mucosa acumulación de líquido, donde la secreción individual de líquidos y niveles de analito son los únicos factores que influyen en la variación interindividual.
Durante el procedimiento de extracción, los analitos se eluyen de los papeles de filtro después de la adición de idénticos volúmenes de buffer para todas las muestras. Esto favorece la dilución similares ex vivo de todas las muestras. Un tampón de extracción de solución salina isotónica base de albúmina se utiliza para el paso de extracción; permite la extracción de mediadores proteínicos y estabiliza las proteínas para limitar desnaturalización durante el subsecuente congelamiento de proteínas eluídas antes de la cuantificación. Para evitar la degradación de las proteínas durante la fase de extracción, un cóctel de inhibidores de la proteasa se añade el tampón de extracción.
La aplicación de técnicas que permiten la cuantificación de no perturbados, en vivo-mediadores inmunes generados en sitios de la mucosa es de suma importancia. En primer lugar, el sitio de la mucosa constituye el órgano inmunológico más grande en el cuerpo. En segundo lugar, la ubicación nasal es el sitio primario de la exposición aerotransportada y está firmemente conectada al compartimiento inmunológico respiratorio de los pulmones1. En tercer lugar, la posibilidad de examinar este importante órgano con una técnica no invasiva abre la posibilidad para proporcionar una gran cantidad de información en el eje de interacción microbio-inmune importante en relación con la salud y la enfermedad de las vías respiratorias. En cuarto lugar, hay muchas otras posibles aplicaciones de esta técnica, como el estudio de alteraciones inmunológicas locales en ensayos controlados aleatorios de fármacos y micronutrientes.
Inicialmente hemos implementado la técnica en los estudios prospectivos de Copenhague sobre el asma en cohorte de2000 (COPSAC2000) de la infancia, donde se determinó el perfil inmune de mucosa revestimiento líquido en niños de 7 años de edad con rinitis alérgica versus controles sanos13. Posteriormente, hemos aplicado con éxito esta técnica longitudinal cohorte2010 de COPSAC y perfiles inmune vía aérea cuotas en 1 mes, 2 años y 6 años de edad y en casos de síntomas respiratorios agudos. Resultados de los neonatos de 1 mes de edad han demostrado asociaciones importantes entre la firma inmune y la exposición ambiental vida temprana7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la técnica presentada aquí, hemos sido capaces de determinar el en vivo vías respiratorias superiores mucosa inmune perfil en niños desde 1 mes de edad, que no se ha hecho previamente. Observamos que esa presencia de bacterias de las vías respiratorias específicas picornavirus7,11, así como pre y otras exposiciones perinatales, se reflejaron en el perfil inmune de las vías respiratorias de los recién nacidos. Además, utilizamos estos datos …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expresamos nuestro agradecimiento a los niños y las familias del estudio de cohorte de2010 COPSAC por todo su apoyo y compromiso. Reconocemos y apreciamos los esfuerzos únicos del equipo de investigación COPSAC y la ayuda técnica de técnico Lisbeth Buus Rosholm, Universidad técnica de Dinamarca, para la medición de citoquinas y quimioquinas.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
