הכנה בינונית של<em> תסיסנית</em> עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).
Abstract
ניתוח אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) הפך לגישה הכרחית לחקר תהליכים ומנגנונים ביולוגיים, כגון איתות תא, התפתחות אורגניזם ומחלות. זה רצוי לעתים קרובות להשיג מידע PPI באמצעות חומר vivo , כדי לקבל את התצוגה הטבעית ביותר ללא דעות מוקדמות של רשתות האינטראקציה. זבוב הפירות תסיסנית melanogaster היא פלטפורמה מצוינת ללמוד PPIs in vivo , וכן משאיל את עצמו גישות פשוטות לבידוד חומר ניסויים ביוכימיים. בפרט, עוברי זבוב הפירות מייצגים סוג נוח של רקמות לבדיקת PPI, בשל הקלות באיסוף בעלי חיים בשלב ההתפתחותי הזה והעובדה שרוב החלבונים באים לידי ביטוי בעובר, ובכך מספקים סביבה רלוונטית לחשוף את רוב ה- PPI. כאן אנו מציגים פרוטוקול אוסף של עוברי תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), אשר הוא סכום אידיאלי עבור מגוון רחב שליישומי proteomic, כולל ניתוח של PPIs על ידי זיקוק טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS). אנו מתארים את העיצובים שלנו עבור כלובים 1 L ו 5 L עבור אוספים העובר כי ניתן בקלות ובזול להגדיר במעבדה כלשהי. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול כללי עבור אוסף העובר ואת החילוץ חלבון לייצר lysates כי ניתן להשתמש ישירות ביישומים במורד הזרם כגון AP-MS. המטרה שלנו היא לספק אמצעי נגיש לכל החוקרים לבצע את הניתוחים של PPIs in vivo .
Introduction
מסכים גנטיים, ולאחרונה, גישות גנומיות חוללו מהפכה במחקר של פונקציות ביולוגיות. עם זאת, מידע סלולרי חשוב מקודדים חלבונים האנסמבל שלהם של שותפים אינטראקציה. בעוד המסכים הגנטיים המסורתיים יכולים לזהות את רכיבי המסלול המגבילים את קצב התגובה ולהחלים אינטראקציות עקיפות, כוחן של הגישות הפרוטאומטיות טמון ביכולתן לזהות רשתות של אינטראקציה מיידית של חלבונים בעלי עניין. פרוטאומיקס היא אפוא שיטת אורתוגונלית חשובה כדי לחקור מערכות ביולוגיות, ומשלימה גנומים, תמלילי טקסטים ומסכים גנטיים מסורתיים. זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS) הוכיח להיות גישה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון חלבון (PPIs) בסביבתם הטבעית בתאים ורקמות 1 , 2 . שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות ישירות או עקיפות בפיתוח ספציפיאל השלבים או רקמות, והוא שימש בהצלחה לזהות PPIs רומן חדש במגוון מסלולים התפתחותיים (הנסקרת בהתייחסות 1 ). למרות ההצלחה הבלתי מעורערת של מחקרים PPI, רובם בוצעו בתאים בתרבית, שבו חלבונים "הפיתיון" של עניין היו overexpressed. ישנם שני נושאים עם חקר PPIs בתרבית תאים: הראשון, קו תא מסוים לא יכול לספק להשלים מלא של אינטראקציות בשל חוסר ביטוי של חלבונים מסוימים. שנית, overexpression גבוה בדרך כלל מועסקים ב ניתוחים כאלה עלול להוביל חפצים כגון חלבונים misfolding או זיהוי של אינטראקציות חיוביות כוזבות.
שתי המגבלות הללו ניתן להתגבר על ידי ניתוח PPIs in vivo . צעד מגביל בניסויים כאלה הוא הזמינות של חומר המוצא לטיהור קומפלקסים חלבונים. תסיסנית melanogaster מזה זמן רב שימש מודל לניתוח פונקציונליSis, ולאחרונה זה הוכח גם להיות מערכת מצוינת לחקר PPIs in vivo . תסמונת עוברים תסיסנית מייצגת סוג רקמה אטרקטיבי במיוחד כדי למדוד PPIs, כי עוברי ניתן לאסוף בקלות בכמויות גדולות, וגם בגלל שרוב הגנים (> 88%) באים לידי ביטוי במהלך embryogenesis, ובכך לספק עשיר בסביבה vivo לאיתור רלוונטי PPIs 3 .
באופן מסורתי, מחקרים ביוכימיים זבובים השתמשו מאוד בקנה מידה גדול אוספים אוספים (100-150 גרם), כגון אלה הדרושים לטהור lysates תעתיק פונקציונלי 4 , 5 . מחקרים קודמים AP-MS ב תסיסנית גם צורך כמויות גדולות של עוברים (5-10 גרם), כי הם הסתמכו על גישה טיהור שני שלבים כגון טיהור זיקה טנדם (TAP), עם אובדן הקשורים של חומר בכל שלב 6 . Amoun גדולTS של חומר המוצא הכרחי הגדרת אוספי העובר בכלובים האוכלוסייה גדול, אשר יכול להיות גם יקר (כאשר רכש מסחרית) ודורש זמן כדי לשמור ולנקות 7 , 8 , 9 .
ההתקדמות לאחרונה בפיתוח של זוויות צעד אחד טיהור זיקה, כמו גם את הרגישות הגוברת של ספקטרומטרים המונית, צמצמו את הכמות הנדרשת של חומר המוצא על ידי סדר גודל. באמצעות תגים כגון פפטיד מחייב streptavidin (SBP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו החל מ 1 גרם של עוברים, ניתן לבודד את כמויות של חלבון הפיתיון רכיבים אינטראקציה זה יהיה מספיק עבור זיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה 10 , 11 .
מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לסייע לחוקרים overcoלי מחסום נתפס ניתוח ביוכימי של PPIs in vivo . לשם כך, אנו מספקים הליך פשוט וזול כדי לאסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), ואחריו הכנה צעד אחד של תמציות חלבון שלם התא המתאימים לניתוח שלאחר מכן על ידי AP-MS או גישות אחרות . השיטה שלנו מסתמכת על שימוש בכלובי אוכלוסייה מותאמים אישית של 1-L או 5-L שניתן לייצר בקלות על ידי כל מעבדה. יתר על כן, תנאי החילוץ המוצגים כאן אומתו במספר מחקרים, הן בתאים בתרבית והן ב- vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן הוא הליך פשוט כללי להקמת כלוב האוכלוסייה תסיסנית בקנה מידה בינוני ועושה תמציות חלבון התא כולו מעוברים. תמציות וכתוצאה מכך ניתן להשתמש במגוון של יישומים במורד הזרם, כגון טיהור של מתחמי חלבון על שרף זיקה. זה קריטי לבצע את שלבי החילוץ על קרח ולה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחברי המעבדה Veraksa להערות מועילות על כתב היד והצעות לשיפורים בפרוטוקול. AV נתמך על ידי NIH מענקים GM105813 ו NS096402. LY נתמך על ידי אוניברסיטת מסצ 'וסטס בוסטון סנופי Genzyme דוקטורט אחוות.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Génétique. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Génétique. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
