Dit protocol beschrijft een Drosophila- leer- en geheugenassessie, genaamd courtship conditioning. Deze klassieke test is gebaseerd op een vermindering van mannelijk hofgedrag na seksuele afwijzing door een non-receptive premated female. Deze natuurlijke vorm van gedragsplasticiteit kan worden gebruikt om leer, kortlopend geheugen en langdurig geheugen te testen.
Veel inzichten in de moleculaire mechanismen die aan het leren en het geheugen liggen, zijn opgemerkt door gebruik te maken van eenvoudige gedragsassays in modelorganismen, zoals de vruchtvlieg , Drosophila melanogaster . Drosophila is nuttig voor het begrijpen van de fundamentele neurobiologie onderliggende cognitieve tekorten die voortvloeien uit mutaties in genen die verband houden met menselijke cognitieve stoornissen, zoals intellectuele handicap (ID) en autisme. Dit werk beschrijft een methodologie voor het testen van leren en geheugen door gebruik te maken van een klassiek paradigma de Drosophila, bekend als courtship conditioning. Mannetje vliegt hofvrouwen aan met behulp van een duidelijk patroon van gemakkelijk herkenbaar gedrag. Voorlopige vrouwen zijn niet ontvankelijk voor paring en zullen de mannelijke copulatiepogingen verwerpen. Als reactie op deze afwijzing verminderen mannelijke vliegen hun hofgedrag. Deze geleerde vermindering van het hofgedrag wordt in de loop van de tijd gemeten, als indicator voor leren en geheugen. De basis numéRical output van deze test is de courtship index (CI), die wordt gedefinieerd als het percentage tijd dat een man in een 10 minuten interval hoft. De leerindex (LI) is de relatieve reductie van CI in vliegen die zijn blootgesteld aan een premated vrouw in vergelijking met naïeve vliegen zonder voorafgaande sociale ontmoetingen. Voor de statistische vergelijking van LI's tussen genotypes wordt een randomisatietest met bootstrapping gebruikt. Om te illustreren hoe de test kan worden gebruikt om de rol van een gen aan te pakken die betrekking heeft op leer en geheugen, werd de pan-neuronale afbraak van Dihydroxyacetonfosfaat-acyltransferase ( Dhap-at ) hier gekarakteriseerd. De menselijke ortholoog van Dhap-at , glyceronfosfaat O-acyltransferase ( GNPT ), is betrokken bij rhizomelische chondrodysplasia punctata type 2, een autosomaal-recessief syndroom dat wordt gekenmerkt door ernstige ID. Door gebruik te maken van de courtship conditioning assay werd vastgesteld dat Dhap-at nodig is voor langdurig geheugen, maar niet voorKortlopend geheugen. Dit resultaat dient als basis voor verder onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen.
De moleculaire mechanismen die aan het leren en het geheugen liggen, worden door heel veel soorten behouden. De baanbrekende werk screening Drosophila melanogaster mutant lijnen voor gebreken in olfactorisch leren en geheugen heeft belangrijke moleculaire inzichten gegeven in de processen die leren en geheugen 1 onderbouwen. In deze studies werden enkele van de eerste genen die betrokken zijn bij leren en geheugen geïdentificeerd, zoals rutabaga 2 , amnesiac 3 en dunce 4 , die een kritische rol voor het signaleren van cyclische adenosine monofosfaat 5 onthullen.
Vroege genetische schermen voor geheugenmutanten werden voornamelijk uitgevoerd met behulp van olfactieve conditionering. Er zijn echter verschillende methoden om andere vormen van leren en geheugen te meten, na verloop van tijd opgetreden. Een van de meest gebruikte leer- en geheugenparadigma's, en de hier beschreven beschrijving, staan bekend als cOnzetship conditioning, die voor het eerst werd beschreven door Siegel en Hall 6 en later werd verfijnd door een aantal andere onderzoeksgroepen 7 , 8 , 9 . Courtship conditionering is afhankelijk van de aanwezigheid van een specifiek feromon, cis- va-acetaat (cVA), op de vrouwelijke buik, die tijdens de copulatie door de man wordt gedeponeerd. Sensatie cVA op de vrouwelijke buik vermindert natuurlijk het hofgedrag, en in combinatie met de daad van afwijzing door het vrouwelijk, is het effect van cVA op mannelijke hofverlaging dramatisch verbeterd. Het antwoord van mannelijke vliegen in deze analyse kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door hun onderscheidend hofgedrag te waarnemen, die wordt gekenmerkt door het oriënteren naar het vrouwelijke en het volgen van het vleugel, tikken, verlengen en vibrerende vleugel, likken en proberen copulatie 10 ( Figuur 1A ). Mannelijke vliegen leren distinguis H tussen receptieve maagd- en niet-ontvankelijke vrouwtjes 11 , en na seksuele afwijzing, laten ze tot 9 dagen een verminderd hofgedrag ten opzichte van non-receptieve vrouwen zien. Dit natuurlijke gedrag kan worden gebruikt om de mechanismen die aan het leren liggen, het korte termijngeheugen (STM) en het langetermijngeheugen (LTM) 8 , 9 , 12 te verklaren. Leren wordt gedefinieerd als de onmiddellijke vermindering van het hofgedrag dat zich voordoet tijdens de trainingsperiode en wordt vaak aangeduid als een onmiddellijk herroepengeheugen, gemeten 0 – 30 minuten na blootstelling aan een gepaard gaande vrouw 6 , 8 . STM wordt gemeten tussen 30 minuten en 1 uur na training, terwijl LTM meestal 24 uur na training 8 gemeten wordt ( Figuur 1B ). STM kan geïnduceerd worden met een 1-u-trainingstijd, maar duurt slechts 2-3 uurS = "xref"> 6 , 8 . In de meeste leerparadigma's kan LTM alleen worden geïnduceerd door middel van sprake van opvallende training. Mcbride et al . (1999) 8 liet zien dat drie afstandsbediening, 1-h trainingssessies voldoende waren om het schipgeheugen voor maximaal 9 dagen in te schakelen, in tegenstelling tot de 2-3 uur geïnduceerd door een enkele 1-h trainingssessie. McBride et al . 8 ook aangetoond dat een enkele 5-h trainingssessie voor een periode van maximaal 9 dagen een vergelijkbaar LTM-respons produceerde. Vliegen hoeven niet voortdurend gerecht te worden tijdens deze 5-uursperiode, waardoor ze hun eigen gespannen training op zichzelf ontwikkelen om LTM in een enkele training te onderdrukken. Dit is van een praktisch oogpunt erg belangrijk, waardoor het gemak waarmee de test kan worden gebruikt, aanzienlijk worden verhoogd. Huidige protocollen gebruiken overwegend een enkele trainingssessie van 7-h voor LTM 11 , 12 . Verschillende studies hebben verschillende onderzochtMutante condities die specifieke gebreken hebben in verschillende aspecten van het leren van het hof. Bijvoorbeeld, mushroom body ablation beïnvloedt STM en LTM, maar niet leren 8 . Mutaties in het amnesiac gen, dat voor het eerst gedefinieerd werd als een specifieke geheugensgeheugen met behulp van olfactorische conditionering 3 , beïnvloedt STM maar niet leert 6 . Ontwrichting van de vertaalregelaar orb2 (oo18 RNA-bindende (orb) CPEB2-subfamilie) en ecdyson-signalering hebben uitsluitend LTM 9 , 13 effect. Zo is het aanpak van een hofdienst een nuttig paradigma om de mechanismen die onderling liggen in de verschillende stadia van leren en geheugen, te ontleden.
Dit werk demonstreert een geoptimaliseerde experimentele setup die het mogelijk maakt om de relatief hoge doorvoerproeven van courtship conditioning te laten uitvoeren. Verder beschrijft het een statistisch analyse script en bespreekt kritische factoren van de analyse. Het is shBezit hier dat het Drosophila- gen Dihydroxyacetonfosfaat-acyltransferase ( Dhap-at ) Is vereist in neuronen voor LTM, maar niet voor STM. De menselijke ortholoog van dit gen, glyceronfosfaat O-acyltransferase ( GNPAT ), is gemuteerd in rhizomelische chondrodysplasia punctata type 2 14 , een autosomale recessieve aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige intellectuele beperking, aanvallen en diverse andere klinische kenmerken 15 . In deze context kan courtship conditionering gebruikt worden om de rol van menselijke ziektegenen in leer en geheugen functioneel te valideren, die een basis vormen voor mechanistische studies.
De courtage conditie test is een klassiek paradigma voor de analyse van leer en geheugen in Drosophila . Het hier gepresenteerde protocol volgt de algemene methodologie die eerder is beschreven 6 , 7 , 8 , 9 maar bevat unieke aspecten zoals praktische richtlijnen, gespecialiseerde apparatuur en een data analyse script 9 , 12 voor randomisatie tests. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om tegelijkertijd grote aantallen vliegen te analyseren met behulp van 96-brede platbodemblokken ( figuur 2A ) om mannen te verzamelen en trainen. De blokken zijn afgesloten met PCR kleefstof, waardoor de vliegen gemakkelijk toegankelijk zijn wanneer nodig. Daarnaast maken de hier beschreven uniek hofkamers mogelijk voor het gelijktijdig koppelen van 18 mannelijke-vrouwelijke paren in een bijna tweedimensionale ruimte die ikS optimaal voor video analyse. De op maat gemaakte hofkamers zijn eenvoudig te gebruiken, en een bouwplan is beschikbaar ( File S1 , Figuur 2D ). Dit protocol, van de oprichting van de culturen die testvakken verzamelen bij de aanschaf van videodata, duurt ongeveer 20 dagen ( tabel 1 ). Extra tijd is nodig voor de analyse van videodata. In onze ervaring is de STM-test extreem robuust. De LTM-analyse is ook vrij robuust, maar het is gevoeliger voor het verwarmen van omgevingsvariabelen en kan daarom moeilijker zijn om te beheersen.
Dierlijk gedrag kan vrij variabel zijn. Daarom moeten kritische stappen in het protocol met zorg worden uitgevoerd om deze variantie te verminderen. Ten eerste zal het zacht gebruik van de aspirator ( figuur 2B ) de stress verminderen die door ruwe hantering kan worden opgelegd of door te sterk uit te blazen. Een voorgestelde methode om het individu over te dragenVliegen uit de aspirator is door gebruik te maken van negatieve geotaxis. Aangezien vliegen de neiging hebben om op te lopen, kan men gewoon de punt van de aspirator opwijzen; Net voordat de vlieg de punt bereikt, is een zachte klap voldoende om de vlieg uit te laten. Bovendien, om de mannen in de kamer te laten vallen alvorens te testen, is een blaas vaak niet nodig.
Een andere belangrijke stap is het verzamelen en genereren van mannelijke proefpersonen. Alle mannen moeten worden verzameld als ze heel jong en sociaal naïef zijn. Dit kan bereikt worden door frequente inzameling tijdens de piekperiodes van eclosie (stap 5.2). Als mannen niet in dit strakke tijdvak worden verzameld, kunnen ze vroege sociale interacties hebben, wat kan leiden tot slecht leren of hoge variabiliteit in CI. Een andere factor mannelijke proefpersonen die moeten worden beoordeeld is de genetische achtergrond. Verschillende genetische achtergronden zullen verschillende niveaus van naïeve verweerders tonen en kunnen ook verschillen in algemene activiteit of locomotorische vaardigheden. Bij compaRing meerdere genotypen, moet er rekening worden gehouden met genetische achtergrond om deze confounding factoren te vermijden die LI scores kunnen beïnvloeden. Daarnaast moet de verdeling van de CI-gegevens zorgvuldig worden beoordeeld. CI-gegevens kunnen zowel parametrisch als niet-parametrisch zijn, afhankelijk van het genotype of andere omgevingsfactoren. In sommige gevallen, als de verdeling van CI drastisch verschuift van een normale verdeling, kan het beter zijn om de mediaan-CI te gebruiken dan de gemiddelde voor de berekening van LI's. In onze ervaring maakt het gebruik van median of gemiddelde CI echter geen verschil in de statistische interpretatie van de gegevens, en het gebruik van de gemiddelde CI is de algemene praktijk in de literatuur.
Voor een succesvolle opscheidingsconditionering is de actieve afwijzing van mannelijke proefschieten door premisse vrouwen in de training periode van cruciaal belang. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de voorgebonden vrouwtjes die in deze test zijn gebruikt, efficiënt georganiseerd zijn en zijnWaardoor geen copulatie mogelijk is. Deze voorspelling is gevestigd in de paringsflacons bereid in stap 4, waar mannelijke en vrouwelijke vliegen gedurende 4 dagen samen worden gehouden ( tabel 1 ). Vervolgens kan paring worden gecontroleerd door regelmatig onderzoek van testvideo's en tijdens het trainen van mannelijke vrouwelijke paren. Als er paring plaatsvindt, zijn er verschillende maatregelen die kunnen worden genomen tijdens de voorbereiding van premated vrouwen. Ten eerste moeten premie-vrouwtjes worden geoogst onder optimale fokomstandigheden. Flesjes kunnen aangevuld worden met gistpasta en een gevouwen filterpapier om potentiële parkeervlakken te vergroten. De incubatie van vliegen onder de hier beschreven omstandigheden heeft in het verleden robuuste premate vrouwtjes geproduceerd, maar dit kan variëren in verschillende laboratoria en met behulp van verschillende genetische stammen. Daarom kan het nodig zijn om de generatie van voorgebonden vrouwen te optimaliseren door de incubatietijd en de omstandigheden te variëren.
Kwantificering van het gedrag van het hof isNog een kritische stap in dit protocol. Dit kan handmatig of automatisch gebeuren met behulp van gespecialiseerde softwareprogramma's 9 . Geautomatiseerde kwantificering is snel en in principe onbevooroordeeld. Verschillende programma's zijn gepubliceerd 21 , 22 , 23 ; Ze zijn echter niet eenvoudig te gebruiken, waarbij vaak gespecialiseerde videoformaten en geavanceerde computervaardigheden nodig zijn. Handmatige kwantificering is eenvoudig en accuraat, maar het is zeer arbeidsintensief en onderhevig aan individuele variabiliteit en vooroordeel. Het is belangrijk om te benadrukken dat dit protocol niet voldoet aan de vereisten voor video-opmaak die mogelijk nodig zijn voor de geautomatiseerde kwantificering van CI's. Voor handmatige kwantificering, gebruik een simpel video-opnameapparaat dat de mogelijkheid heeft om een video van voldoende kwaliteit te produceren om het gedrag van de rechter te waarnemen. Voor geautomatiseerde kwantificering zal er waarschijnlijk anders zijnEisen afhankelijk van de gebruikte software, en gebruikers moeten dit grondig onderzoeken als geautomatiseerde kwantificering gewenst is.
In combinatie met de uitgebreide gereedschappen die beschikbaar zijn voor de genetische manipulatie van vliegen, biedt de courtage conditional assay een robuuste uitlezing die kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen en neuronale netwerken die betrokken zijn bij leren en geheugen te ontleden.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen het Wenen Drosophila Resource Center voor het leveren van de Drosophila stammen. Bovendien werden voorraden verkregen uit het Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) in deze studie gebruikt. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het FP7 grootschalige geïntegreerde netwerk Gencodys van de Europese Unie aan KK, HvB en AS en door NSERC Discovery en CIHR Project Grants aan JMK
P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
Razor blade | – | – | Any sharp will do |
Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
power food | |||
Agar | Sigma | A7002 | |
Yeast | Bruggeman | – | |
Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
Peptone | Sigma | P6838 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – | ||
Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
normal food | |||
Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
Yeast | bruggeman | – | |
Corn flour | de Molen | – | |
Sugar | de Molen | – | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – |