白蝶貝からの内生菌の抽出方法<em>ベミシア・タバチ</em
Summary
ここでは、白斑Bemisia tabaciからの内胚葉を切開および濾過により単離するためのプロトコールを提示する。増幅後、DNAサンプルは、その後のシークエンシングおよび内寄生虫とコナジラミ間の共生の研究に適している。
Abstract
細菌共生生物は、宿主と親密な関係を形成し、ほとんどの場合宿主に利点を与える。ゲノム情報は、宿主における細菌共生生物の機能および進化を研究するために重要である。ほとんどの共生物質はインビトロで培養できないため、ゲノム配列決定のために適切な量の細菌を単離する方法は非常に重要です。コナジラミBemisia tabaciでは、いくつかの内寄生虫が同定されており、複数のアプローチによる有害生物の発生および生殖において重要であると予測されている。しかし、協会を支える仕組みはほとんど知られていません。この障害は部分的に、白癬菌の内在性物質（ほとんどが細菌細胞に抑制されている）が宿主細胞から分離するのが困難であるという事実に由来する。ここでは、主に解剖学的検査によって白癬B. tabaciからの内在性物質の同定、抽出および精製のための段階的プロトコールを報告するオンにして濾過する。この方法によって調製された内毒素試料は、依然として異なる内毒素種の混合物であるが、その後のゲノム配列決定およびバチルス・タバチにおける内在性の可能な役割の分析に適している。この方法は、他の昆虫から内生菌を単離するためにも使用することができる。
Introduction
節足動物1では 、相対的な宿主と密接な共生関係を形成する細菌が広がっている1 。内分泌攪乱物質は、栄養代謝、繁殖、環境ストレスへの応答2,3、4などのような宿主の局面にほとんど全ての発育段階5において影響を及ぼすことが実証されている5 。しかし、協会の基盤となる仕組みはまだほとんど知られていません。ゲノミクスは、細菌の潜在的な機能と役割を研究する際に重要かつ重要です。いくつかの基本的な情報、 すなわち 、分類学的状態、機能遺伝子、代謝経路、分泌系は、共生している共生生物の潜在的役割についての光を放出するゲノム配列から推測することができる。ハイスループット配列決定の開発により、膨大な数の細菌ゲノムが配列決定されている様々な機能を明らかに6 。
内寄生虫は、アブラムシ7 、ナンキンムシ8 、オオバコ9 、褐斑病10および蝉11などの半翅類において極めて重要である。例えば、アブラムシのBuchneraは、必須の共生生物として、アブラムシのゲノム12由来の遺伝子とともに、必須のアミノ酸生合成に関与することが示されている。さらに、 ブフネラ（Buchnera）の転写調節もまた明らかにされている13 。 オオバコでは、 Carsonellaが配列決定され、今までに発見された最小の細菌ゲノムにランクされている14 。これらの内在性の特徴はすべて、ゲノム配列に基づいて推測されます。これらの内在性物質はインビトロで培養することができないので、seqのために適切な細菌を単離するためにいくつかのアプローチが適用されている覚醒する。アブラムシでは、遠心分離および濾過により内腔菌を抽出し、さらなるゲノムおよび転写分析に供する5 。褐斑病菌では、昆虫ゲノム10全体とともに内生菌が配列決定される10 。
Whitefly B. tabaciは、35種以上の形態学的に区別不能な種（潜在種）を含む種複合体であり、そのうち2種の侵略種が世界中に侵入し、農業生産に多大な害をもたらした15 。注目すべきことに、 B. tabaci種内の内在性物質は、害虫16の発生において重要であることを示している。今日まで、8種の内在性物質が、 ハリネリチア 、 リケッチア 、 アルセノフォヌス 、 カルディニウム 、em> Wolbachia、 FritschaおよびHemipteriphilusは、17,18を定義した。
以前に記載された半体とは異なり、コナジラミB. tabaciはわずか1mmの非常に小さな昆虫である。ほとんどの内在性物質は、バクテリア細胞19 （B細胞において細菌をさらに形成する共生物質を含む特殊細胞）に限定される。さらに、これらの内在性物質はインビトロで培養することができない。バチルス・タバチ（ B. tabaci）から内寄生虫を得るための唯一の方法は、細菌を解剖することである。しかし、解剖が困難である。第一に、脆弱な細菌は、常に分離するのは難しい白蝶の他の組織とつながります。第二に、白蝶の小さなサイズは、十分な細菌の分離を制限する。第3に、内在性細菌は細菌の中に集まり、単一の細菌種を獲得することを非常に複雑にする。
<p clここでは、後のメタゲノム配列決定のために白コバの内在性を単離するための簡単で安価なプロトコルを報告する。解剖、精製および増幅により、適切な内在性DNAを得ることができ、細菌の種を確認することができた。記載されたプロトコールは、他の節足動物においても同様に使用することができる。Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の財政的支援は、国家主要研究開発計画（2016YFC1200601）と中国国立自然科学財団（31390421）によって提供された。
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O’Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
