Ekspansjon og adipogeneseinduksjon av adipocytprogenitorer fra perivaskulær adiposevev isolert ved magnetisk aktivert cellesortering
Summary
Her rapporterer vi en metode for isolering av Adipocyte Progenitor Cell (APC) populasjoner fra Perivascular Adipose Tissue (PVAT) ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MCS). Denne metoden tillater økt isolering av APC per gram fettvev i sammenligning med fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
Abstract
Utvidelse av perivaskulær adiposvæv (PVAT), en stor regulator av vaskulær funksjon gjennom parakrinsignalering, er direkte relatert til utvikling av hypertensjon under fedme. Omfanget av hypertrofi og hyperplasi er avhengig av depotplassering, kjønn, og typen av adipocytprogenitorcelle (APC) fenotyper tilstede. Teknikker brukt til APC og preadipocytter isolasjon de siste 10 årene har drastisk forbedret nøyaktigheten ved hvilke enkelte celler kan identifiseres basert på spesifikke celleoverflate markører. Imidlertid kan isolering av APC og adipocytter være en utfordring på grunn av cellens skjøthet, spesielt hvis den intakte celle beholdes for cellekulturapplikasjoner.
Magnetisk aktivert cellesortering ( MCS) gir en metode for å isolere større antall levedyktig APC per vektenhet av fettvev. APC høstet av MCS kan brukes til in vitro- protokoller for å utvide preaDipocytter og differensiere dem til adipocytter ved bruk av vekstfaktor-cocktailer som muliggjør analyse av det potensielle og adipogene potensialet som beholdes av cellene. Dette eksperimentet fokuserte på aorta- og mesenteriske PVAT-depotene, som spiller sentrale roller i utviklingen av kardiovaskulær sykdom under ekspansjon. Disse protokollene beskriver metoder for å isolere, utvide og differensiere en definert befolkning av APC. Denne MCS-protokollen tillater isolasjon å brukes i ethvert eksperiment hvor celle sortering er nødvendig med minimal utstyr eller trening. Disse teknikkene kan bistå ytterligere eksperimenter for å bestemme funksjonaliteten til spesifikke cellepopulasjoner basert på tilstedeværelsen av celleoverflate markører.
Introduction
Perivaskulær Adipose Tissue (PVAT), på grunn av sin nærhet til blodkar, er en viktig parakrin signalering komponent i vaskulatur funksjon 1 . Utvidelse av dette fettvev er avhengig av fenotypen av Adipocyte Progenitor Cells (APC) tilstede 2 , 3 . Isolering av celler fra fettvev er vanskelig da primære adipocytter er skjøre, flytende og varierer i størrelse. Visse isolasjonsteknikker kan også endre cellefenotype og morfologi ved å øke inflammatorisk proteinsyntese og redusere adipogen genuttrykk 4 , understreker betydningen av en protokoll som opprettholder integriteten til cellene.
Kultur av primære celler og spesifikke preadipocyt-subpopulasjoner gir en reduktivistisk tilnærming til vekst i in vivo og opprettholder ekvivalent cellulær genetisk sminke 5 , selv om man arbeider tiMeg med disse cellene er begrenset på grunn av forverring med aldring eller senescence 6 . Preadipocytter fra forskjellige adipose depots, inkludert subkutane og omental depoter, viser også forskjeller i proliferation 7 , som understreker viktigheten av å samle celler fra bestemte anatomiske steder. Forløperceller fra ikke-PVAT hvite adipose depoter har blitt preget av tidligere studier 7 , 8 , 9 , men mindre er kjent om PVAT APC fenotyper.
Teknologiene beskrevet her tillater analyse av spesifikke og definerte APC-populasjoner med minimal innvirkning på deres morfologi, levedyktighet og potensial til å proliferere og differensiere. Magnetisk aktivert cellesortering (MCS) er egnet til nedstrømsapplikasjoner, for eksempel kultur, da perlene oppløses uten å endre cellen. MCS er også økonomisk, og når antistoffet conSentreringer har blitt standardisert, behovet for strømningscytometrianalyser er minimal. In vitro- studier med PVAT-forløpere kan også gi et glimt av potensialet som disse primære cellene kan ha.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det sentrale fokuset i foreliggende eksperiment er isolering, ekspansjon og adipogen induksjon av APC fra PVAT-depoter. Her presenterer vi en protokoll for isolering av APC basert på identifisering av celler som uttrykker overflate markørene CD34 og PDGFRα. Disse overflateproteiner ble tidligere identifisert på APC med høye proliferasjonshastigheter og potensialet til å differensiere til hvite eller brune adipocytter i forskjellige adipose depots 14 , 15 ….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Contreras og Watts Laboratories og Dr. William Raphael. Disse forsøkene ble støttet av NHLBI F31 HL128035-01 (vevsfordøyelsesprotokoll standardisering), NHLBI 5R01HL117847-02 og 2P01HL070687-11A1 (dyr) og NHLBI 5R01HL117847-02 (celleisolasjon og kultur).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
