यहां हम चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमसीएस) का उपयोग करते हुए पेरीविस्कुलर एडिपोज टिशू (पीवीएटी) से एडिपोसाइट प्राइजेंट सेल (एपीसी) की आबादी के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। फ्लोरोसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) की तुलना में इस पद्धति में एडीपीस टिश्यू प्रति ग्राम एपीसी की वृद्धि हुई अलगाव के लिए अनुमति देता है।
पेरासिराइन सिग्नलिंग के जरिए संवहनी समारोह के प्रमुख नियामक पेरीविस्कुलर एडिपोज टिश्यू (पीवीएटी) का विस्तार, मोटापा के दौरान उच्च रक्तचाप के विकास से सीधे संबंधित है। हाइपरट्रॉफी और हाइपरप्लासिया की सीमा डिपो स्थान, लिंग, और एडीपोकेट प्राइजनीटर सेल (एपीसी) के प्रोनोटिप्स के प्रकार पर निर्भर करती है। एपीसी और प्रीडिपोसाइट्स अलगाव के लिए पिछले 10 वर्षों में इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों ने सटीकता में काफी सुधार किया है, जिस पर विशिष्ट कोशिका सतह मार्करों के आधार पर व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है। हालांकि, सेल की नाजुकता के कारण एपीसी और एडीओपोसाइट्स का अलगाव एक चुनौती हो सकता है, खासकर अगर कोशिका संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए बरकरार कोशिका को बनाए रखा जाना चाहिए।
मेगनेटिक-सक्रिय सेल सॉर्टिंग ( एमसीएस) एडीपोज ऊतक के वजन इकाई के प्रति अधिक व्यावहारिक एपीसी को अलग करने की एक विधि प्रदान करता है। एमसीएस द्वारा खरीदे गए एपीसी का उपयोग इन विट्रो प्रोटोकॉल में विस्तार करने के लिए किया जा सकता हैडिपोसाइट्स और कोशिकाओं द्वारा बनाए रखने वाले विपुल और एडिपोजेनिक क्षमता के विश्लेषण के लिए अनुमति देने वाले विकास कारक कॉकटेल के उपयोग के माध्यम से उन्हें एडिपोसाइटेज़ में अलग करना। इस प्रयोग ने महाधमनी और एमजेन्ट्रिक पीवीएटी डिपो पर ध्यान केंद्रित किया, जो विस्तार के दौरान हृदय रोग के विकास में प्रमुख भूमिका निभाते हैं। ये प्रोटोकॉल एपीसी की परिभाषित आबादी को अलग करने, विस्तार और भिन्न करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। यह एमसीएस प्रोटोकॉल किसी भी प्रयोग में अलगाव का उपयोग करने की अनुमति देता है जहां सेल सॉर्टिंग की न्यूनतम उपकरण या प्रशिक्षण के लिए आवश्यक है। ये तकनीक सेल की सतह के मार्करों की उपस्थिति के आधार पर विशिष्ट सेल आबादी की कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए आगे प्रयोगों की सहायता कर सकती हैं।
रक्त वाहिकाओं से निकटता के कारण पेरिवस्कुलर एडिपोज टिशू (पीवीएटी), vasculature फ़ंक्शन 1 में एक बड़ा पैरासिरेन सिग्नलिंग घटक है। इस वसा ऊतक का विस्तार एडीओपोसाइट प्राइजेंट सेल (एपीसी) के फेनोटाइप 2 , 3 पर निर्भर है। वसा के ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव मुश्किल है क्योंकि प्राथमिक एडिटॉसाइट्स नाजुक, उमंग, और आकार में रेंज हैं। कुछ पृथक तकनीकों में भड़काऊ प्रोटीन संश्लेषण बढ़ाना और एडीजीजनिक जीन एक्सप्रेशन 4 को कम करके सेल फ़िनोटाइप और आकृति परिवर्तन भी बदल सकता है, जो एक प्रोटोकॉल के महत्व पर बल देता है जो कि कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखता है।
प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति और विशिष्ट प्रीडाइपोसाइट उप-जनसंख्याएं विवो वृद्धि में कमी लाने वाला दृष्टिकोण देती हैं और समान सेलुलर आनुवंशिक श्रृंगार 5 रखती हैं, हालांकि काम कर रहे टीआईमैं इन कोशिकाओं के साथ उम्र बढ़ने या शताब्दी के साथ गिरावट के कारण सीमित है चमड़े के नीचे और आंशिक डिपो सहित विभिन्न वसा डिपो से प्रेडियोपोसाइट्स भी प्रसार 7 में अंतर प्रदर्शित करते हैं, जो विशिष्ट शारीरिक साइट्स से कोशिकाओं को एकत्रित करने के महत्व पर जोर देते हैं। गैर-पीवीएटी सफेद वसा डिपो से प्रीकर्सर कोशिकाओं को पिछले 7 , 8 , 9 के अध्ययन में देखा गया है, लेकिन पीवीएटी एपीसी फेनोटाइप के बारे में कम जानकारी है।
यहां वर्णित तकनीक विशिष्ट और परिभाषित एपीसी आबादी के विश्लेषण के लिए उनके आकारिकी, व्यवहार्यता, और पैदा करने और विभेद करने की क्षमता पर न्यूनतम प्रभाव के साथ अनुमति देते हैं। मेगनेटिक-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमसीएस) डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के लिए अनुकूल है, जैसे कि संस्कृति, क्योंकि मोती कोशिका को बदलने के बिना भंग कर देते हैं। एमसीएस भी किफ़ायती है, और एक बार एंटीबॉडी कॉनकेंद्रीकरण को मानकीकृत कर दिया गया है, फ्लो साइटमैट्री एशेज की आवश्यकता कम है पीवीएटी पूर्ववर्तियों के साथ इन विट्रो अध्ययनों में यह संभावना भी हो सकती है कि ये प्राथमिक कोशिकाएं हो सकती हैं।
वर्तमान प्रयोग का मुख्य फोकस पीवीएटी डिपो से एपीसी के अलगाव, विस्तार और एडीजीजनिक प्रेरण है। यहां हम सतह के मार्करों CD34 और PDGFRα को व्यक्त करने वाले कोशिकाओं की पहचान के आधार पर एपीसी के अलगाव के लिए एक ?…
The authors have nothing to disclose.
कॉन्ट्रेरास और वाट लेबोरेटरीज और डॉ विलियम रैफेल। इन प्रयोगों का समर्थन NHLBI F31 HL128035-01 (टिशू पाचन प्रोटोकॉल मानकीकरण), एनएचएलबीआई 5R01HL117847-02 और 2P01HL070687-11A1 (जानवरों), और एनएचएलबीआईआरआरआरएच 0 9 8 9 7847-02 (सेल अलगाव और संस्कृति) द्वारा किया गया था।
Tissue Dissection | |||
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
KRBB Solution | |||
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
HEPES | Corning | 25-060-CI | |
Tissue Digestion | |||
Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
Cell Isolation | |||
OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
(DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
Cell Culture | |||
CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
Cell Analysis | |||
CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |